การจัดลำดับดีเอ็นเอ: MAXAM-GILBERT วิธีการและตัวอย่าง - ชีววิทยา - 2026

การจัดลำดับดีเอ็นเอ (กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก) เป็นขั้นตอนในห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยาที่ช่วยให้ทราบลำดับของนิวคลีโอไทด์ในสารพันธุกรรมที่สนใจ นอกจากนี้ยังสามารถเปิดเผยลำดับของ RNA (กรดไรโบนิวคลีอิก)

เทคนิคนี้เป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้สำหรับการพัฒนาวิทยาศาสตร์ชีวภาพ นอกจากนี้ยังสามารถใช้ได้กับความรู้ด้านอื่น ๆ เช่นการวินิจฉัยทางการแพทย์และการสืบสวนทางนิติเวชเป็นต้น

ที่มา: pixabay.com

ก่อนหน้านี้การจัดลำดับของสายดีเอ็นเอถือเป็นกิจกรรมที่ช้าและมีราคาแพงซึ่งอนุญาตให้ระบุคู่เบสเพียงไม่กี่คู่ในโอลิโกนิวคลีโอไทด์

วันนี้ด้วยความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์การหาลำดับดีเอ็นเอจึงเป็นงานประจำในห้องปฏิบัติการหลายแห่งทั่วโลกด้วยผลงานวิจัยเกือบ 50 ปีในสาขานี้ ในแง่ของความยาวโซ่สามารถเรียงลำดับคู่ฐานได้มากถึงล้านคู่ในเวลาอันสั้น

ในการทำเช่นนี้มีเทคนิคมากมายที่พัฒนาขึ้นซึ่งมีราคาและความแม่นยำแตกต่างกันไป ในบทความนี้เราจะอธิบายเทคนิคทั้งแบบคลาสสิกและแบบสมัยใหม่โดยแต่ละเทคนิคมีข้อดีและข้อเสีย

จนถึงปัจจุบันเทคนิคการจัดลำดับช่วยให้ได้ลำดับของจีโนมที่สมบูรณ์ตั้งแต่โปรคาริโอตและยีสต์ขนาดเล็กไปจนถึงจีโนมของมนุษย์

โครงสร้างดีเอ็นเอ

เพื่อให้เข้าใจถึงวิธีการและเทคนิคที่ใช้ในการจัดลำดับดีเอ็นเอจำเป็นต้องรู้ลักษณะสำคัญบางประการของโครงสร้างและองค์ประกอบของโมเลกุล

DNA เป็นสารชีวโมเลกุลที่พบในสิ่งมีชีวิตทุกชนิดตั้งแต่แบคทีเรียไปจนถึงสัตว์น้ำขนาดใหญ่ ออร์แกเนลล์เช่นไมโตคอนเดรียและคลอโรพลาสต์มีโมเลกุลดีเอ็นเอเป็นวงกลมอยู่ภายใน แม้ในไวรัสบางชนิดสารพันธุกรรมที่พบคือดีเอ็นเอ

โครงสร้างดีเอ็นเอคือชุดของนิวคลีโอไทด์ แต่ละตัวประกอบด้วยคาร์โบไฮเดรตฐานไนโตรเจน (A, T, C หรือ G) และกลุ่มฟอสเฟต เป้าหมายของการจัดลำดับดีเอ็นเอคือการเปิดเผยลำดับที่พบฐานไนโตรเจนทั้งสี่ในลำดับ

ประวัติศาสตร์

ในช่วงกลางทศวรรษ 1950 นักวิจัยวัตสันและคริกได้อธิบายโครงสร้างของดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคคริสตอลกราฟฟิค อย่างไรก็ตามไม่มีนักวิจัยคนใดเลยที่สามารถหาทางคลี่คลายลำดับได้

แม้ว่าจะมีรุ่นก่อน ๆ อยู่บ้างเหตุการณ์ที่สำคัญที่สุดคือการสร้างวิธีการแซงเจอร์ในปี 1977 เฟรดเดอริคแซงเจอร์บิดาของวิธีการนี้เป็นนักชีวเคมีชาวอังกฤษซึ่งได้รับรางวัลโนเบลสองรางวัลจากผลงานอันยิ่งใหญ่ของเขาในด้านวิทยาศาสตร์ชีวภาพ

เทคนิคนี้รู้จักกันในวรรณคดีว่า "chain termination" หรือ dideoxynucleotides หลักการของเทคนิคนี้และหลักการที่ได้รับการพัฒนาโดยอาศัยการปรับปรุงและนวัตกรรมจะอธิบายไว้ด้านล่าง

วิธีการแซงเจอร์

การพัฒนาวิธีการแซงเจอร์เป็นเหตุการณ์สำคัญในอณูชีววิทยา มันเกี่ยวข้องกับส่วนประกอบพื้นฐานของกระบวนการจำลองแบบดีเอ็นเอที่ปกติเกิดขึ้นในเซลล์ แต่จะเพิ่มส่วนประกอบพิเศษ: dideoxynucleotides

ส่วนประกอบหลักของปฏิกิริยา

- DNA polymerase: เอนไซม์ DNA polymerase เป็นองค์ประกอบสำคัญของกระบวนการ โมเลกุลนี้มีส่วนร่วมในการจำลองแบบของสายดีเอ็นเอและบทบาทของมันคือการสังเคราะห์เส้นใยใหม่โดยจับคู่ไตรฟอสเฟตดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์กับโมเลกุลเสริม

จำไว้ว่าใน DNA ไทมีน (T) จับคู่กับอะดีนีน (A) ผ่านพันธะไฮโดรเจนสองพันธะในขณะที่ไซโตซีน (C) ทำเช่นนั้นกับกัวนีน (G) ผ่านสามพันธะ

- นิวคลีโอไทด์: การเรียงลำดับของ Sanger เกี่ยวข้องกับนิวคลีโอไทด์สองประเภทคือ 2'-deoxynucleotides สี่ตัว (ย่อว่า dATP, dGTP, dCTP และ dTTP) และ dideoxynucleotides ทั้งสี่ (ddATP, ddGTP, ddCTP และ ddTTP)

แม้ว่า dideoxynucleotides จะคล้ายกับโมโนเมอร์ที่รวมอยู่ใน DNA ตามปกติ แต่ก็ไม่มีกลุ่ม -OH ในโครงสร้าง ทำให้ไม่สามารถเพิ่มนิวคลีโอไทด์ใหม่ให้กับโซ่ได้

ดังนั้นเมื่อมีการเติมนิวคลีโอไทด์แบบพิเศษลงในห่วงโซ่ที่ก่อตัวแบบสุ่มโดยสิ้นเชิงการสังเคราะห์จะเป็นอัมพาต ดังนั้นในตอนท้ายของปฏิกิริยาจะมีโซ่ที่มีขนาดแตกต่างกันซึ่งแต่ละอันเกิดปฏิกิริยาหยุดที่จุดต่างกัน

ในการทดลองมีการเตรียมการทดสอบสี่แบบ แต่ละชนิดประกอบด้วยดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างทางชีววิทยาที่สนใจนิวคลีโอไทด์ปกติและนิวคลีโอไทด์ชนิดพิเศษหนึ่งในสี่ชนิด นิวคลีโอไทด์พิเศษทั้งสองชนิดจะถูกทำเครื่องหมายด้วยเครื่องหมายเรืองแสงบางประเภท (ดูลำดับอัตโนมัติด้านล่าง)

การอ่านผลลัพธ์

ขั้นตอนแรกคือการแยกโซ่สังเคราะห์แต่ละเส้นตามขนาดของมัน บางอันจะยาวกว่าอันอื่นขึ้นอยู่กับว่าฐานพิเศษถูกรวมเข้าไว้ที่ใด

มีเทคนิคทางชีวเคมีที่แตกต่างกันที่อนุญาตให้แยกส่วนประกอบของสารผสมโดยใช้ขนาดเป็นคุณสมบัติในการเลือกปฏิบัติ ในวิธีการของแซงเจอร์โซ่ที่แตกต่างกันจะถูกคั่นด้วยอิเล็กโตรโฟรีซิส ในเทคนิคที่มีความซับซ้อนมากขึ้นจะใช้อิเล็กโตรโฟรีซิสของเส้นเลือดฝอย

ดังนั้นเส้นที่ยาวกว่าจึงเดินทางน้อยกว่าสายพันธุ์ที่สั้นกว่า จากนั้นระบบนี้จะผ่านเครื่องอ่านที่จดจำเครื่องหมายที่รวมอยู่ในไดโอดอกซีนิวคลีโอไทด์แต่ละตัว ด้วยวิธีนี้จะทำให้ทราบลำดับของลำดับได้

เทคนิค "รุ่นแรก" นี้สามารถอ่านชิ้นส่วนดีเอ็นเอได้ไม่เกิน 1 กิโลเบส ในปัจจุบันวิธีการแซงเจอร์ถูกใช้ในห้องปฏิบัติการต่างๆโดยทั่วไปจะเป็นรูปแบบที่ทันสมัย นอกจากนี้ยังใช้เพื่อยืนยันผลลัพธ์ที่ได้รับด้วยเทคนิคที่ซับซ้อนที่สุด แต่แม่นยำน้อยกว่า

ลำดับอัตโนมัติ

เมื่อต้องใช้การจัดลำดับในปริมาณมากกระบวนการจะถูกเร่งผ่านระบบอัตโนมัติ นี่เป็นรูปแบบหนึ่งของวิธีการยกเลิกโซ่ Sanger โดยที่ไพรเมอร์จะติดฉลากด้วยผลิตภัณฑ์เรืองแสงเพื่อแยกความแตกต่าง

ต่อจากนั้นผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาจะทำงานในอิเล็กโทรโฟรีซิส - ทั้งหมดอยู่บนเลนเดียว เมื่อชิ้นส่วนแต่ละชิ้นออกจากส่วนสุดท้ายของเจลจะถูกระบุอย่างรวดเร็วโดยการติดฉลากเรืองแสงโดยมีข้อผิดพลาดประมาณ 1%

ระบบที่ซับซ้อนที่สุดมีระบบเส้นเลือดฝอยมากถึง 96 หลอดที่จัดการโดยคอมพิวเตอร์ควบคู่ไปกับหุ่นยนต์ นั่นคือสามารถทดสอบดีเอ็นเอ 96 ตัวอย่างพร้อมกันได้ ดังนั้นกระบวนการที่เกี่ยวข้องกับอิเล็กโทรโฟรีซิสและการวิเคราะห์ผลลัพธ์จึงเป็นไปโดยอัตโนมัติ

ในหนึ่งวันระบบเหล่านี้สามารถจัดลำดับฐานได้ถึง 550,000 ฐาน ในระหว่างกระบวนการไม่จำเป็นต้องใช้แรงงานมนุษย์ใช้เวลาประมาณ 15 นาทีในการเริ่มต้นวิธีการ

การจัดลำดับ Maxam-Gilbert

ในเวลาเดียวกันกับที่ Sanger ตีพิมพ์ผลงานของเขานักวิจัยสองคนชื่อ Allan Maxan และ Walter Gilbert ประสบความสำเร็จในการพัฒนาวิธีการอื่นเพื่อให้ได้ลำดับดีเอ็นเอ วิธีนี้ได้รับความนิยมในเวลานั้น แต่ต่อมาถูกแทนที่ด้วยการปรับปรุงวิธีการของแซงเจอร์

ตรงกันข้ามกับวิธีการของ Sanger การจัดลำดับ Maxan และ Gilbert (หรือการจัดลำดับทางเคมีตามที่ทราบกันดี) ไม่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาการผสมพันธุ์ วิธีการนี้ประกอบด้วยการติดฉลากด้วยสารทำปฏิกิริยาที่ปลายด้านหนึ่งตามด้วยกระบวนการทำให้บริสุทธิ์

หนึ่งในแง่ลบของเทคนิคนี้คือความซับซ้อนมหาศาลและในการใช้สารเคมีที่เป็นอันตรายต่อผู้ใช้ การแตกตัวของสารเคมีเกิดจากการใช้ DMS กรดฟอร์มิกไฮดราซีนและไฮดราซีนด้วยเกลือ

กระบวนการ

โปรโตคอลเริ่มต้นด้วยการติดฉลากที่ปลาย 5 'ของเกลียวด้วยเครื่องหมายฟอสฟอรัส 32 จากนั้นการดัดแปลงทางเคมีของฐานไนโตรเจนจะเกิดขึ้นและแยกออกจากกัน ในที่สุดความแตกแยกของภูมิภาค abasic ก็เกิดขึ้น

ก่อนอื่นคุณต้องตัดสตริงที่คุณต้องการจัดลำดับให้สั้นลง ขั้นตอนนี้ดำเนินการด้วยเอนไซม์ จำกัด ซึ่งส่งผลให้ปลายยื่นออกมา

ถัดไปปฏิกิริยาจะดำเนินการกับอัลคาไลน์ฟอสฟาเทสซึ่งมีจุดประสงค์เพื่อกำจัดกลุ่มฟอสเฟต ดังนั้นจึงสามารถใช้โพลีนิวคลีโอไทด์ไคเนสเพื่อทำการติดฉลากได้

โซ่ถูกทำให้ใหม่ (ทั้งสองเส้นเปิด) จากนั้นจึงใช้สารเคมี ปฏิกิริยาความแตกแยกเหล่านี้ทำในลักษณะที่ควบคุมได้และเป็นที่ทราบกันดีว่าพันธะประเภทใดในการแบ่งสารเคมีแต่ละชนิด

การอ่านผลลัพธ์

เช่นเดียวกับวิธีการแซงเจอร์การอ่านผลลัพธ์จะเกี่ยวข้องกับการแยกตามขนาดของโซ่ที่ได้รับในระบบอิเล็กโตรโฟรีซิส ระบบที่ประกอบด้วยโพลีอะคริลาไมด์ทำให้ได้ความละเอียดที่เพียงพอสำหรับการอ่านเจล

การจัดลำดับมวล

การจัดลำดับขนาดใหญ่ประกอบด้วยชุดวิธีการใหม่ ๆ ซึ่งเรียกโดยย่อว่า NGS จากภาษาอังกฤษ“ Next Generation Sequencing”

วิธีการที่จัดประเภทเป็น NGS จำเป็นต้องมีขั้นตอนการขยาย DNA ก่อนหน้านี้ (ไม่สามารถใช้ได้กับโมเลกุลเดี่ยว) นอกจากนี้แพลตฟอร์มที่ใช้ก็แตกต่างกันไป หลักการของวิธีการที่นิยมมากที่สุดจะอธิบายไว้ด้านล่าง:

Pyrosequencing

เกี่ยวข้องกับการตรวจสอบการปลดปล่อยไพโรฟอสเฟตซึ่งเกิดขึ้นทุกครั้งที่มีการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ใหม่ในสายดีเอ็นเอ ระบบของเอนไซม์ทำงานร่วมกันเพื่อให้การปล่อยแสง (ซึ่งตรวจจับได้ด้วยกล้อง) เกิดขึ้นทุกครั้งที่มีการรวมนิวคลีโอไทด์ใหม่

กระบวนการเริ่มต้นด้วยการบ่มแยกแต่ละฐานไนโตรเจนเพื่อตรวจสอบว่ามีการเปล่งแสงหรือไม่ Pyrosequencing สามารถอ่านเส้นยาวได้ แต่อัตราความผิดพลาดที่พบนั้นสูง

การจัดลำดับการสังเคราะห์

สิ่งนี้เกี่ยวข้องกับการรวมตัวของนิวคลีโอไทด์ที่มีฉลาก ส่วนประกอบเรืองแสงเหล่านี้ถูกเพิ่มล้างและบันทึกนิวคลีโอไทด์ที่รวมเข้าด้วยกัน จากนั้นป้ายชื่อนิวคลีโอไทด์จะถูกลบออกและการสังเคราะห์เส้นใยจะดำเนินต่อไปได้ ในขั้นตอนต่อไปจะมีการรวมนิวคลีโอไทด์ที่มีป้ายกำกับไว้ด้วยและจะทำขั้นตอนข้างต้นซ้ำ

ข้อเสียของเทคนิคนี้เกิดขึ้นเมื่อไม่ได้ลบเครื่องหมายเรืองแสงออกอย่างสมบูรณ์ การปล่อยเหล่านี้สร้างข้อผิดพลาดเบื้องหลังทำให้เกิดข้อผิดพลาดที่สำคัญ

การจัดลำดับคดี

เทคนิคนี้แตกต่างจากเทคนิคอื่น ๆ เนื่องจากไม่ใช้ DNA polymerase แต่เอนไซม์สำคัญสำหรับวิธีนี้คือ ligase ที่นี่มีการใช้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ติดฉลากเรืองแสงโดยมีการเชื่อมโยงโดยเอนไซม์และตรวจพบ

ปัญหาที่ใหญ่ที่สุดของเทคนิคนี้คือความยาวส่วนที่สั้นซึ่งสามารถประมวลผลได้

ลำดับไอออนทอร์เรนต์

เทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับการวัดของไอออน H ⁺ที่ปล่อยออกมาทุกครั้งที่มีการรวมนิวคลีโอไทด์ใหม่ หลักการค่อนข้างคล้ายกับ pyrosequencing แต่ราคาถูกกว่ามาก

ตัวอย่าง

ลำดับของจีโนมมนุษย์

การจัดลำดับจีโนมของมนุษย์เป็นหนึ่งในความท้าทายที่มีแนวโน้มมากที่สุดในชีววิทยาและยังเป็นหนึ่งในการแข่งขันที่ได้รับการยกย่องมากที่สุดในประวัติศาสตร์วิทยาศาสตร์ ในความเป็นจริงสำหรับนักวิทยาศาสตร์ที่เกี่ยวข้องกับโครงการการจัดลำดับจีโนมกลายเป็นการแข่งขัน

ในปี 1990 เขาได้เริ่มต้นสิ่งที่เรียกว่า "โครงการจีโนมมนุษย์" นำโดยเจมส์วัตสันนักวิทยาศาสตร์ชื่อดังเจ้าของรางวัลโนเบล หลังจากนั้นหนึ่งปีในปี 1991 Venter ได้รับความท้าทายในการ "เอาชนะ" วัตสันและจัดลำดับจีโนมต่อหน้าเขา อย่างไรก็ตามในปี 1992 วัตสันเกษียณอายุและนักวิจัยอีกคนได้รับคำสั่ง

ในปี 1995 Venter ได้ประกาศความสำเร็จของเขาในการจัดลำดับจีโนมของแบคทีเรียโดยวิธีสุ่มลำดับ ในทำนองเดียวกันทีมตรงข้ามประกาศหนึ่งปีต่อมาถึงลำดับของจีโนมยีสต์

ในปีพ. ศ. 2543 ปริญญาได้สิ้นสุดลง ทั้งสอง บริษัท ได้เผยแพร่ผลการวิจัยจีโนมเบื้องต้นทั้งหมดในวารสารที่มีชื่อเสียงที่สุดของวิทยาศาสตร์ 2 ฉบับ ได้แก่ ธรรมชาติและวิทยาศาสตร์

อย่างไรก็ตามนักวิทยาศาสตร์ยังคงดำเนินการปรับปรุงข้อเสนอดังกล่าวต่อไปและในปี 2549 ลำดับของโครโมโซมของมนุษย์ก็เสร็จสมบูรณ์

ความสำคัญและการใช้งาน

การรู้ลำดับของนิวคลีโอไทด์ของโมเลกุลที่สำคัญเช่น DNA นั้นมีประโยชน์ต่อนักชีววิทยาและผู้เชี่ยวชาญที่เกี่ยวข้อง สายโซ่ของพอลินิวคลีโอไทด์นี้มีข้อมูลทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาและการบำรุงรักษาสิ่งมีชีวิตทุกรูปแบบ

ด้วยเหตุนี้ความรู้เกี่ยวกับลำดับนี้จึงจำเป็นสำหรับการวิจัยทางชีววิทยา โดยพื้นฐานแล้วการจัดลำดับทำให้สามารถวัดคุณสมบัติที่สำคัญที่สุดอย่างหนึ่งของระบบชีวภาพและสร้างความแตกต่างระหว่างพวกมันได้

การจัดลำดับใช้กันอย่างแพร่หลายโดยนักอนุกรมวิธานและนักจัดระบบเนื่องจากลำดับดีเอ็นเอบางอย่างทำให้สามารถกำหนดเกณฑ์เพื่อสรุปได้ว่าสิ่งมีชีวิตสองชนิดเป็นสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันหรือไม่นอกจากนี้ยังสามารถเสนอสมมติฐานเกี่ยวกับความสัมพันธ์ทางวิวัฒนาการระหว่างพวกมันได้

นอกจากนี้การจัดลำดับดีเอ็นเอยังมีการประยุกต์ใช้ในทางการแพทย์และการวินิจฉัย ตัวอย่างเช่นมีระบบที่ราคาไม่แพงและสามารถเข้าถึงได้โดยการจัดลำดับช่วยให้สามารถประเมินแนวโน้มที่จะเกิดโรคบางชนิด (เช่นมะเร็ง) โดยใช้สิ่งที่เรียกว่า single nucleotide polymorphisms (SNPs)

การสืบสวนประเภทอาชญากรและนิติวิทยาศาสตร์ยังได้รับการเสริมด้วยเทคนิคการจัดลำดับซึ่งสามารถใช้เป็นหลักฐานที่เชื่อถือได้ในการมีส่วนร่วมของบุคคลบางคนในการก่ออาชญากรรม

อ้างอิง

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). ลำดับของซีเควนเซอร์: ประวัติของการจัดลำดับดีเอ็นเอ จีโนมิกส์, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013) การปฏิวัติการจัดลำดับยุคใหม่และผลกระทบต่อจีโนมิกส์ เซลล์, 155 (1), 27-38
3. เลวี่เจ. (2010). การแข่งขันทางวิทยาศาสตร์ จากกาลิเลโอไปจนถึงโครงการจีโนมของมนุษย์ บรรณาธิการ Paraninfo.
4. Sanger, F. , Nicklen, S. , & Coulson, AR (1977) การจัดลำดับดีเอ็นเอด้วยสารยับยั้งการยุติสายโซ่ การดำเนินการของสถาบันวิทยาศาสตร์แห่งชาติ, 74 (12), 5463-5467
5. ชูสเตอร์, เซาท์แคโรไลนา (2550). การจัดลำดับยุคใหม่เปลี่ยนชีววิทยาในปัจจุบัน วิธีธรรมชาติ, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Ed.). (2014) ลำดับรุ่นต่อไป Caister สำนักพิมพ์วิชาการ.