MÜELLER HINTON AGAR: พื้นฐานการเตรียมและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2026

Mueller Hinton วุ้นไม่ได้เลือกสื่อสารอาหารที่เป็นของแข็งประกอบด้วยการแช่เนื้อเปปโตนเคซีนกรด, แป้ง, วุ้นและน้ำกลั่น สารนี้ช่วยให้จุลินทรีย์เจริญเติบโตได้ดีเยี่ยมสำหรับแบคทีเรียที่เติบโตเร็วที่สุด

เดิมถูกสร้างขึ้นโดย John Howard Müellerและ Jane Hinton เพื่อแยกแบคทีเรียที่ต้องการสารอาหารเช่น Neisseria gonorrhoeae และ Neisseria meningitidis อย่างไรก็ตามเนื่องจากลักษณะของมันจึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการศึกษาความไวต่อยาปฏิชีวนะซึ่งให้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้และทำซ้ำได้

ยาปฏิชีวนะ (Müeller Hinton agar) ที่มา: Dr Graham Beards จาก en.wikipedia

ดังนั้นMüeller Hinton agar จึงเป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้รับการยอมรับจาก Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) และ European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing สำหรับประสิทธิภาพของการทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพโดยวิธี Kirby disk diffusion และ บาวเออร์

รากฐาน

เป็นอาหารที่มีคุณค่าทางโภชนาการที่ไม่ผ่านการคัดเลือกจึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่ก่อโรคส่วนใหญ่

ในทางกลับกันองค์ประกอบที่เรียบง่ายทำให้สารแพร่กระจายได้ง่ายซึ่งเป็นลักษณะสำคัญสำหรับการทดสอบความอ่อนไหวโดยวิธีการแพร่กระจายของดิสก์

อีกลักษณะหนึ่งคือมีสารยับยั้งในปริมาณต่ำซึ่งช่วยให้สามารถประเมิน sulfonamides, trimethoprim และ tetracyclines ได้อย่างมีประสิทธิภาพ

อย่างไรก็ตามควรระลึกไว้เสมอว่าสื่อต้องเป็นไปตามเงื่อนไขบางประการเพื่อให้แน่ใจว่ามีการทำงานที่เหมาะสม ได้แก่ :

การปรับค่า pH, ความลึกของวุ้นและความเข้มข้นที่เหมาะสมของมีน, thymidine, แคลิฟอร์เนีย⁺⁺ , Mg ⁺⁺และ Zn ++

คุณต้องรู้ด้วยว่าวิธีการนั้นเป็นมาตรฐานดังนั้นจึงต้องตรงตามพารามิเตอร์ทั้งหมดเช่น:

ความเข้มข้นของหัวเชื้อความเข้มข้นและการอนุรักษ์ของแผ่นยาปฏิชีวนะการจัดวางจานจำนวนที่เหมาะสมบนวุ้นระยะห่างระหว่างแผ่นหนึ่งกับอีกแผ่นหนึ่งการวางกลยุทธ์ของยาปฏิชีวนะบางชนิดบรรยากาศอุณหภูมิและเวลาของ การบ่ม

การจัดเตรียม

ชั่งน้ำหนักตัวกลางMüeller Hinton ที่ขาดน้ำ 37 กรัมแล้วละลายในน้ำกลั่น 1 ลิตร ตั้งไฟกลางให้ร้อนขณะกวนเพื่อช่วยในการละลาย ต้ม 1 นาที

นึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที เมื่อนำออกจากหม้อนึ่งควรวางขวดไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 50 ° C เพื่อให้เย็น เท 25 ถึง 30 มล. ลงในจานเพาะเชื้อที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 10 ซม. ปลอดเชื้อ

แผ่นควรมีความหนาเฉลี่ย 4 มม. (เหมาะอย่างยิ่ง) อนุญาตให้มีช่วง 3-5 มม.

หากต้องการเตรียมวุ้นเลือดโดยใช้วุ้นMüeller Hinton เป็นฐานให้เทเลือดแกะที่ผ่านการฆ่าเชื้อและละลายน้ำแข็ง 5% ก่อนเสิร์ฟบนจาน

pH สุดท้ายของตัวกลางควรอยู่ระหว่าง 7.2 ถึง 7.4

ลงทุนและเก็บในตู้เย็นจนกว่าจะใช้ ปล่อยให้จานอยู่ในอุณหภูมิห้องก่อนใช้

สีของสื่อที่เตรียมไว้คือสีเบจอ่อน

การประยุกต์ใช้งาน

ใช้เพื่อทำการทดสอบยาปฏิชีวนะหรือการทดสอบความไวต่อยาปฏิชีวนะสำหรับเชื้อโรคที่ไม่ต้องการการเจริญเติบโตอย่างรวดเร็วส่วนใหญ่

หากวุ้นได้รับการเสริมด้วยเลือดจะใช้ในการให้ยาปฏิชีวนะของจุลินทรีย์ที่ต้องการเช่น Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis เป็นต้น นอกจากนี้ยังใช้ในการแยกเชื้อ Legionella pneumophila

เทคนิค Antibiogram

ก่อนดำเนินการให้ยาปฏิชีวนะต้องเตรียมสารละลายแบคทีเรียที่มีขนาดเท่ากับ 1.5 x 10 ⁸เซลล์

ด้วยเหตุนี้เชื้อบริสุทธิ์ 3 ถึง 4 โคโลนีจะถูกนำไปแขวนไว้ในน้ำซุปทริปซิเคสถั่วเหลืองหรือในน้ำซุปMüeller Hinton โดยบ่มเป็นเวลา 2 ถึง 6 ชั่วโมงและปรับความเข้มข้นด้วยน้ำเกลือปราศจากเชื้อเปรียบเทียบกับมาตรฐานของ Mac Farland 0.5%

หากพวกมันต้องการจุลินทรีย์สามารถแขวนโคโลนีได้โดยตรงที่ความเข้มข้น 0.5% Mac Farland ต่อจากนั้นแผ่นMüeller Hinton จะถูกเพาะด้วยไม้กวาดชุบด้วยสารละลายแบคทีเรียที่เตรียมไว้

ในการทำเช่นนี้ให้จุ่มไม้กวาดลงในสารละลายจากนั้นของเหลวส่วนเกินจะถูกขจัดออกโดยการกดกับผนังของท่อ หลังจากนั้นทันทีไม้กวาดจะถูกส่งไปทั่วพื้นผิวโดยไม่ให้มีการแตะต้องจากนั้นจานจะหมุนเล็กน้อยและนำไปเพาะอีกครั้ง การดำเนินการซ้ำอีก 2 ครั้ง

ปล่อยให้ยืนเป็นเวลา 10 นาทีจากนั้นใส่แผ่นยาปฏิชีวนะด้วยคีมฆ่าเชื้อโดยเว้นระยะห่างไว้ 24 มม. หลังจากวางดิสก์แต่ละแผ่นลงบนวุ้นแล้วให้กดแผ่นดิสก์แต่ละแผ่นเบา ๆ ด้วยคีมเพื่อให้แน่ใจว่ายึดได้ดี

เมื่อกระบวนการเสร็จสิ้นแผ่นจะกลับด้านและบ่มที่อุณหภูมิ 35-37 ° C ในแอโรบิคเป็นเวลา 16 ถึง 18 ชั่วโมง หากเป็นจุลินทรีย์ที่มีความต้องการก็อาจได้รับเชื้อ microaerophilia และหากยาปฏิชีวนะมีแผ่น oxacillin ควรอ่านหลังจาก 24 ชั่วโมง

ไม้บรรทัดใช้วัดเส้นผ่านศูนย์กลางของรัศมีแต่ละอัน ควรบันทึกผลลัพธ์เป็นมม. จากนั้นค่าที่ได้จะมีความสัมพันธ์กับตารางของจุดตัดที่เผยแพร่โดยคู่มือ CLSI ปัจจุบัน

การวัดรัศมีการยับยั้ง ที่มา: USCDCP, Pixnio.com

รายงานว่ามีความละเอียดอ่อน (S) ระดับกลาง (I) หรือความต้านทาน (R) แล้วแต่กรณี

ยาปฏิชีวนะจะถูกเลือกตามจุลินทรีย์ที่แยกได้และประเภทของเชื้อที่ผลิต

บางครั้งต้องคำนึงถึงตำแหน่งเชิงกลยุทธ์ของยาปฏิชีวนะเพื่อเปิดเผยรูปแบบการต่อต้านฟีโนไทป์

การจัดวางดิสก์เชิงกลยุทธ์บนวุ้นMüeller Hinton

สำหรับเอนเทอโรแบคทีเรียควรวางแผ่นกรดคลาวูลานิกไว้กับเซฟาโลสปอรินรุ่นที่ 3 และ 4 การขยายรูปไข่บ่งชี้ว่าสายพันธุ์นี้เป็นผู้ผลิต beta-lactamases (ESBL) แบบขยายสเปกตรัม ซึ่งหมายความว่าผู้ป่วยไม่ควรได้รับการรักษาด้วยเซฟาโลสปอรินใด ๆ

การแสดงออกของฟีโนไทป์ของการผลิต beta-lactamase (ESBL) แบบขยายสเปกตรัมในสายพันธุ์ Escherichia coli ที่มา: ภาพถ่ายโดยผู้เขียน MSc. Marielsa Gil

ใน Staphylococcus สิ่งสำคัญคือต้องวาง erythromycin หรือ azithromycin disk ไว้ด้านหน้าของ clindamycin disk (D-test)

รัศมีที่ต้านทานได้ใน erythromycin และการแบนในรัศมีของ clindamycin บ่งชี้ว่าสายพันธุ์นี้มีความต้านทานต่อ clindamycin ที่ทำให้เกิดความเครียด (ICR) ซึ่งหมายความว่าการรักษาด้วยคลินดามัยซินจะไม่ได้ผล

ในการค้นหาสายพันธุ์ AMP C ที่กินไม่ได้ใน Enterobacteriaceae และแท่งแกรมลบที่ไม่ผ่านการหมักบางชนิดแผ่น tazobactan ceftazidime, cefoxitin หรือ piperacillin จะต้องเผชิญกับแผ่น imipenem ที่ระยะ 27 มม.

รัศมีที่แบนราบในดิสก์แผ่นหนึ่งที่หันหน้าไปทาง imipenem บ่งชี้ว่ามี AMP C ที่ไม่สามารถใช้งานได้

สำหรับการค้นหา C-AMP ที่เป็นส่วนประกอบจะต้องใช้ดิสก์ cloxacillin ขนาด 500 µg กับ ceftazidime (30 µg) และ cefotaxime (30 µg) ที่ระยะ 25 มม. รัศมีที่กว้างขึ้นในเซฟาโลสปอรินใด ๆ บ่งบอกถึงความเป็นบวก

นอกจากนี้ยังสามารถเปลี่ยนดิสก์ cloxacillin ด้วยดิสก์ขนาด 9 มม. ของกระดาษกรอง Whatman No. 6 ที่ชุบด้วยกรดฟีนิลบอริก (400 µg) ที่มีระยะห่าง 18 มม. มันถูกตีความเช่นเดียวกับก่อนหน้านี้

ในที่สุดเพื่อตรวจสอบการผลิต metallobetalactamases โดยเฉพาะอย่างยิ่งใน Pseudomonas aeruginosa แผ่นดิสก์ที่ชุบด้วย ethylenediaminetetraacetic acid 10 µl (EDTA 750 µg) และกรด thioglycolic (SMA 300 µg) ซึ่งต้องเผชิญกับ imipenem และ meropenem discs ที่ระยะ 15 มม.

การทดสอบจะเป็นไปในเชิงบวกหากมีการขยับขยายของ imipenem หรือ meropenem halos ไปทางดิสก์ EDTA / SMA ผลลัพธ์นี้ต้องได้รับการยืนยันโดยการทดสอบ Hodge ที่แก้ไขแล้ว

วิธีนี้ประกอบด้วยการฉีดวัคซีนเชื้อ Escherichia coli ATCC 25922 บนจานMüeller Hinton ดิสก์ imipenem ถูกวางไว้ตรงกลางของเพลตจากนั้นมีการสร้างริ้วจากดิสก์ไปยังรอบนอกด้วยสายพันธุ์ P. aeruginosa ที่น่าสงสัย สามารถทดสอบได้ถึง 4 สายพันธุ์ต่อจาน

การทดสอบจะเป็นบวกหากมีโซนของการบิดเบือนของรัศมี imipenem รอบ ๆ เครื่องหมายยืด

สาเหตุของผลลัพธ์ที่ผิดพลาด

- แผ่นยาปฏิชีวนะที่เก็บรักษาไว้ไม่ดีสามารถสร้างความต้านทานที่ผิดพลาดได้ ตัวอย่างเช่น oxacillin disk มีความเสี่ยงมากต่อการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิ

-A pH ของตัวกลางด้านล่างที่ระบุ (เป็นกรด) ก่อให้เกิดรัศมีขนาดเล็กในอะมิโนไกลโคไซด์และแมคโคไลด์ (เสี่ยงต่อการดื้อยาผิดพลาด) และฮาโลสขนาดใหญ่ในเพนิซิลลินเตตราไซคลินและโนโวบิโอซิน (เสี่ยงต่อความไวที่ผิดพลาด)

- หาก pH สูงกว่าที่ระบุไว้ (ด่าง) ผลกระทบที่อธิบายไว้ข้างต้นจะกลับรายการ

- สื่อที่มีความเข้มข้นของไทมีนและไทมิดีนสูงมีอิทธิพลโดยการลดฮาโลสยับยั้งของซัลโฟนาไมด์และไตรเมโธพริมลงอย่างมีนัยสำคัญ

- แคลเซียมและแมกนีเซียมที่มีความเข้มข้นสูงทำให้เกิดความต้านทานที่ผิดพลาดของอะมิโนไกลโคไซด์, โพลีมีซินบีและเตตราไซคลีนต่อสายพันธุ์ของ Pseudomonas aeruginosa

- ความเข้มข้นต่ำของแคลเซียมและแมกนีเซียมทำให้เกิดความไวที่ผิดพลาดของ aminoglycosides, polymyxin B และ tetracyclines ต่อสายพันธุ์ของ Pseudomonas aeruginosa

- การปรากฏตัวของสังกะสีมีผลต่อผลลัพธ์ของแผ่น carbapenem (imipenem, meropenem และ ertapenem)

- ความหนาของสื่อที่ต่ำกว่า 3 มม. ให้ผลลัพธ์ความไวที่ผิดพลาดในขณะที่ความหนาที่สูงกว่า 5 จะสร้างความต้านทานที่ผิดพลาด

- การเคลื่อนย้ายแผ่นดิสก์ในยาปฏิชีวนะจะทำให้มีรัศมีที่ผิดรูปเนื่องจากการปล่อยยาปฏิชีวนะจะเกิดขึ้นทันที

- หัวเชื้อที่อ่อนแอมากส่งผลต่อผลลัพธ์เนื่องจากวุ้นจะไม่มีการเจริญเติบโตสม่ำเสมอหรือมาบรรจบกันซึ่งเป็นเงื่อนไขที่จำเป็นเพื่อให้สามารถวัดรัศมีการยับยั้งได้นอกเหนือจากข้อเท็จจริงที่ว่ารัศมีสามารถให้ขนาดใหญ่กว่าปกติได้

- inocula ที่โหลดมากเกินไปสามารถให้รัศมีที่เล็กกว่าปกติได้

- การไม่เคารพระยะห่างระหว่างแผ่นดิสก์ทำให้รัศมีหนึ่งซ้อนทับกับอีกแผ่นหนึ่งและไม่สามารถอ่านได้อย่างถูกต้อง

-Incubate with CO _{2 จะ}เพิ่มขนาดของ halos ของ tetracycline และ methicillin discs

- การบ่มที่อุณหภูมิต่ำกว่า 35 ° C จะทำให้เกิดรัศมีที่ใหญ่ขึ้น

- การเติมเลือดทำให้ขนาดของซัลฟาลดลง

การ จำกัด

ความไวของยาปฏิชีวนะที่แสดงให้เห็นในยาปฏิชีวนะต่อจุลินทรีย์ (ในหลอดทดลอง) ไม่ได้เป็นการรับประกันว่าจะใช้ได้ผลในร่างกาย

ระบบประกันคุณภาพ

หากต้องการทราบว่าตัวกลางมีไทมีนในปริมาณที่เพียงพอหรือไม่ต้องปลูกสายพันธุ์ Enterococcus faecalis ATCC 29212 และต้องทดสอบความไวต่อยา trimethoprim sulfamethoxazole (SXT) ต้องให้รัศมีเท่ากับหรือ> 20 มม. จึงจะพอใจ

อ้างอิง

1. "วุ้นMüller-Hinton" Wikipedia สารานุกรมเสรี 16 พ.ย. 2018, 12:23 UTC. 27 ม.ค. 2019 04:22 น
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
3. Cona E. เงื่อนไขสำหรับการศึกษาความไวที่ดีโดยการทดสอบการแพร่กระจายของวุ้น เรฟชิลติดเชื้อ 2545; 19 (2): 77-81
4. ห้องปฏิบัติการ Difco Francisco Soria Melguizo วุ้นMüeller Hinton ผสมเลือดแกะ 5% 2552 ดูได้ที่: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agar Laboratory 2017 ดูได้ที่: .bd.com
6. Britannia Laboratories วุ้นMüeller Hinton 2558 ดูได้ที่: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา 5th ed. กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
8. Martínez-Rojas D. betalactamases ประเภท AmpC: ทั่วไปและวิธีการตรวจหาฟีโนไทป์ รายได้ Soc. Ven. Microbiol 2009; 29 (2): 78-83. มีจำหน่ายที่: scielo.org
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. การตรวจหาฟีโนไทป์ของ metallobetalactamases ในเชื้อทางคลินิกของ Pseudomonas aeruginosa คาสเมร่า, 2555; 40 (2): 113-121. มีจำหน่ายที่: scielo.org