RECOMBINANT DNA: เทคนิคการใช้งานและปัจจัยพื้นฐาน - ชีววิทยา - 2026

ดีเอ็นเอ (rDNA หรือ rDNA) เป็นเทียมโมเลกุลของกรดนิวคลีอิกที่สร้างขึ้นในห้องปฏิบัติการโดยการบูรณาการทั้งสองกลุ่มขององค์กรที่น่าสนใจ เป็นที่รู้จักกันในชื่อ chimeric DNA ด้วยคุณสมบัติลูกผสม ไม่พบดีเอ็นเอชนิดนี้ในธรรมชาติ

วิธีการพื้นฐานในการสร้างมันรวมถึง: (ก) การเลือกดีเอ็นเอเป้าหมายและการแทรกในชิ้นส่วนดีเอ็นเออื่น (โดยทั่วไปคือพลาสมิดของแบคทีเรีย); (b) การนำพลาสมิดนี้เข้าสู่แบคทีเรีย (c) การคัดเลือกแบคทีเรียโดยใช้ยาปฏิชีวนะและสุดท้าย (ง) การแสดงออกของยีน

ที่มา: pixabay.com

เทคนิคนี้ใช้ประโยชน์จากชุดของเอนไซม์ที่ทำให้สามารถคัดลอกและวางชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงได้ตามวิจารณญาณของนักวิจัย

เป้าหมายของเทคโนโลยีรีคอมบิแนนท์คือในกรณีส่วนใหญ่การแสดงออกของโปรตีน (เรียกว่าโปรตีนรีคอมบิแนนท์) ที่นักชีววิทยาระดับโมเลกุลต้องการสำหรับการวิจัยในอนาคตหรือเพื่อสร้างโปรตีนที่มีคุณค่าทางการค้าและการรักษาเช่นอินซูลินของมนุษย์ ตัวอย่างเช่น.

พื้นฐานของเทคนิค recombinant DNA และการใช้ในพันธุวิศวกรรม

ความเชื่อกลางของอณูชีววิทยา

สิ่งมีชีวิตอินทรีย์ทั้งหมดที่เรารู้จักมีลักษณะหลายประการ หนึ่งในนั้นคือธรรมชาติของสารพันธุกรรมและวิธีการสร้างโปรตีนซึ่งเป็นกระบวนการที่เรียกว่า "หลักปฏิบัติ" ของอณูชีววิทยา

ยกเว้นไวรัสสองสามตัวสิ่งมีชีวิตทั้งหมดจะเก็บข้อมูลทางพันธุกรรมไว้ใน DNA (กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก) ซึ่งรวบรวมด้วยวิธีที่กะทัดรัดและจัดระเบียบในนิวเคลียสของเซลล์

สำหรับการแสดงออกของยีนโมเลกุลของดีเอ็นเอจะถูกถ่ายทอดเป็นสารอาร์เอ็นเอและส่วนหลังจะถูกแปลเป็นภาษาของกรดอะมิโนซึ่งเป็นส่วนประกอบของโปรตีน

recombinant DNA คืออะไร?

ระหว่างทศวรรษ 1970 และ 1980 นักชีววิทยาระดับโมเลกุลเริ่มใช้ประโยชน์จากกระบวนการที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติภายในเซลล์และสามารถคาดคะเนสิ่งเหล่านี้ไปยังห้องปฏิบัติการได้

ด้วยวิธีนี้ยีนที่มาจากสัตว์ (เช่นสัตว์มีกระดูกสันหลัง) สามารถแทรกเข้าไปในส่วนของ DNA จากแบคทีเรียได้ หรือดีเอ็นเอของแบคทีเรียสามารถรวมกับดีเอ็นเอของไวรัสได้ ดังนั้นเราสามารถกำหนดดีเอ็นเอรีคอมบิแนนต์เป็นโมเลกุลที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตสองชนิดที่แตกต่างกัน

เมื่อสร้างโมเลกุลไฮบริดหรือรีคอมบิแนนต์แล้วยีนที่สนใจจะแสดงออกมา ด้วยการแสดงออกของคำเราต้องการอ้างถึงกระบวนการแปลเป็นโปรตีน

เอนไซม์และลิเกส จำกัด : กุญแจสำคัญในกระบวนการนี้

องค์ประกอบสำคัญในการพัฒนาเทคโนโลยีดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์คือการค้นพบเอนไซม์ จำกัด

เหล่านี้เป็นโมเลกุลของโปรตีนที่แสดงความสามารถในการแยกดีเอ็นเอ (นิวคลีเอส) ออกเป็นลำดับเฉพาะโดยทำหน้าที่เป็น "กรรไกรโมเลกุล" ชิ้นส่วนที่สร้างโดยเอนไซม์เหล่านี้เรียกว่าเศษข้อ จำกัด

กล่าวว่าเอนไซม์สามารถสร้างการตัดแบบสมมาตรตามลำดับเป้าหมาย (ในทั้งสองโซ่ที่ความสูงเท่ากัน) หรือการตัดแบบไม่สมมาตร ลักษณะสำคัญของการทำงานของเอนไซม์ จำกัด คือหลังจากความแตกแยกของโซ่แล้วจะได้ "ขอบหลวม" เสริมกับขอบอีกด้านที่ตัดด้วยเอนไซม์เดียวกัน

ตัวอย่างบางส่วน ได้แก่ ECOR 1 และ Sma 1 ปัจจุบันมีเอนไซม์ จำกัด มากกว่า 200 ชนิดเป็นที่รู้จักและมีจำหน่ายทั่วไป

เพื่อให้เป็นประโยชน์ต้องใช้กรรไกรพร้อมกับกาว การปิดผนึกของ DNA นี้ (ก่อนหน้านี้ได้รับการรักษาด้วยเอนไซม์ จำกัด ) ดำเนินการโดย ligases

เทคนิค: DNA ของสิ่งมีชีวิตถูกดัดแปลงโดยเทียมในห้องปฏิบัติการอย่างไร?

ด้านล่างนี้เราจะอธิบายขั้นตอนหลักที่เทคโนโลยี recombinant DNA ต้องการ ทั้งหมดดำเนินการโดยผู้เชี่ยวชาญในห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยา

"โคลน" คืออะไร?

ก่อนที่จะดำเนินการตามขั้นตอนการทดลองต่อไปเราต้องสังเกตว่าในอณูชีววิทยาและเทคโนโลยีชีวภาพมีการใช้คำว่า "โคลน" และคำกริยา "โคลน" กันอย่างแพร่หลาย ซึ่งอาจนำไปสู่ความสับสน

ในบริบทนี้เราไม่ได้หมายถึงการโคลนสิ่งมีชีวิตทั้งหมด (เช่นในกรณีของแกะดอลลี่ที่มีชื่อเสียงเป็นต้น) แต่หมายถึงการโคลนชิ้นส่วนของดีเอ็นเอซึ่งอาจเป็นยีน นั่นคือการผลิตสำเนาจำนวนมาก - เหมือนกันทางพันธุกรรม - ของลำดับ

1. การแยกและการได้รับดีเอ็นเอ

ขั้นตอนแรกคือการตัดสินใจว่าคุณต้องการใช้ลำดับใด ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับผู้วิจัยและวัตถุประสงค์ของงานของเขา ดีเอ็นเอนี้จะต้องถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์ วิธีการและขั้นตอนในการบรรลุเป้าหมายนี้ขึ้นอยู่กับร่างกายและเนื้อเยื่อ

โดยทั่วไปเนื้อเยื่อจะถูกนำไปและอยู่ภายใต้การบำบัดด้วยการสลายบัฟเฟอร์ด้วยโปรตีนเอสเค (เอนไซม์โปรตีโอไลติก) จากนั้นจึงแยกดีเอ็นเอออก ต่อจากนั้นสารพันธุกรรมจะแตกกระจายเป็นชิ้นส่วนเล็ก ๆ

2. การโคลนเวกเตอร์

หลังจากขั้นตอนการเตรียมการผู้วิจัยพยายามที่จะนำส่วนของดีเอ็นเอที่สนใจไปใช้ในเวกเตอร์โคลน จากนี้ไปเราจะเรียกส่วนนี้ว่า DNA white DNA

พลาสมิด

เวกเตอร์ที่ถูกใช้มากที่สุดชนิดหนึ่งในพลาสมิดจากแหล่งกำเนิดแบคทีเรีย พลาสมิดเป็นโมเลกุลดีเอ็นเอแบบเกลียวคู่ที่พบได้ตามธรรมชาติในแบคทีเรีย พวกมันเป็นสิ่งแปลกปลอมในโครโมโซมของแบคทีเรียนั่นคือพวกมันเป็น extrachromosomal และพบได้ตามธรรมชาติในโปรคาริโอตเหล่านี้

องค์ประกอบพื้นฐานของเวกเตอร์คือ: (ก) ต้นกำเนิดของการจำลองแบบซึ่งทำให้สามารถสังเคราะห์ดีเอ็นเอได้ (b) ตัวแทนการคัดเลือกซึ่งทำให้สามารถระบุสิ่งมีชีวิตที่มีพลาสมิดกับดีเอ็นเอเป้าหมายเช่นความต้านทานต่อยาปฏิชีวนะบางชนิด และ (c) multicloning site ซึ่งพบลำดับที่เอ็นไซม์ จำกัด จะรับรู้

ดีเอ็นเอรีคอมบิแนนต์ที่ประสบความสำเร็จครั้งแรกในห้องปฏิบัติการถูกโคลนลงในพลาสมิด pSC101 จากแบคทีเรียอีโคไล สิ่งนี้มีข้อ จำกัด สำหรับเอนไซม์ที่ จำกัด EcoRI และยีนสำหรับการต่อต้านยาปฏิชีวนะนอกเหนือจากที่มาของการจำลองแบบ

การแทรกดีเอ็นเอเป้าหมายในพลาสมิดนั้นดำเนินการโดยใช้เครื่องมือระดับโมเลกุลของเอนไซม์ จำกัด และลิเกสที่อธิบายไว้ในหัวข้อก่อนหน้านี้

ประเภทเวกเตอร์ที่เหลือ

นอกจากพลาสมิดแล้ว DNA ยังสามารถแทรกเข้าไปในเวกเตอร์อื่น ๆ ได้เช่น bacteriophage lambda, cosmids, YACs (โครโมโซมเทียมของยีสต์), BACs (โครโมโซมเทียมของแบคทีเรีย) และ phagemids

3. การแนะนำของ recombinant DNA

เมื่อได้รับโมเลกุลดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์ (ยีนที่น่าสนใจในพลาสมิดหรือเวกเตอร์อื่น ๆ ) แล้วจะถูกนำเข้าสู่สิ่งมีชีวิตที่เป็นโฮสต์หรือโฮสต์ซึ่งอาจเป็นแบคทีเรียได้

ในการนำ DNA แปลกปลอมเข้าสู่แบคทีเรียจะใช้เทคนิคที่เรียกว่าการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียซึ่งสิ่งมีชีวิตต้องได้รับการบำบัดด้วยไอออนบวกที่ทำให้เกิดการแยกตัวซึ่งทำให้ไวต่อการดูดซึมดีเอ็นเอ

ตามวิธีการแล้วเราไม่สามารถรับประกันได้ว่า 100% ของแบคทีเรียในวัฒนธรรมของเราได้ดูดซับโมเลกุลดีเอ็นเอของเราอย่างมีประสิทธิภาพ นี่คือส่วนของพลาสมิดที่มีการดื้อยาปฏิชีวนะเข้ามามีบทบาท

ดังนั้นแบคทีเรียที่จับพลาสมิดจะดื้อต่อยาปฏิชีวนะบางชนิด ในการเลือกพวกเขาจะเพียงพอที่จะใช้ยาปฏิชีวนะดังกล่าวและนำผู้รอดชีวิต

4. "เก็บเกี่ยว" โปรตีน

หลังจากเลือกแบคทีเรียด้วยดีเอ็นเอรีคอมบิแนนท์ของเราแล้วเราจะใช้เครื่องจักรเอนไซม์ของโฮสต์เพื่อสร้างผลิตภัณฑ์โปรตีนที่สนใจ เมื่อแบคทีเรียแพร่พันธุ์พลาสมิดจะถูกส่งต่อไปยังลูกหลานดังนั้นจึงไม่สูญหายไประหว่างการแบ่งตัว

ขั้นตอนนี้ใช้แบคทีเรียเป็น "โรงงาน" โปรตีนชนิดหนึ่ง หลังจากนั้นเราจะเห็นว่าเป็นขั้นตอนที่เกี่ยวข้องอย่างมากในการพัฒนาการรักษาทางการแพทย์ที่มีประสิทธิภาพ

เมื่อการเพาะเลี้ยงพร้อมและแบคทีเรียได้สร้างโปรตีนจำนวนมากเซลล์จะถูกสลายหรือหยุดชะงัก มีเทคนิคทางชีวเคมีมากมายที่ช่วยให้โปรตีนบริสุทธิ์ตามลักษณะทางเคมีกายภาพของพวกมัน

ในบริบทการทดลองอื่นเราอาจไม่สนใจที่จะสร้างโปรตีน แต่เราสนใจที่จะได้รับลำดับดีเอ็นเอตามลำดับ หากเป็นกรณีนี้พลาสมิดจะถูกใช้เพื่อสร้างสำเนาของชิ้นส่วนที่สนใจหลายชุดเพื่อให้มีดีเอ็นเอเป้าหมายเพียงพอที่จะทำการทดลองที่เกี่ยวข้อง

การประยุกต์ใช้งาน

เทคโนโลยีรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอเปิดโอกาสให้เกิดความเป็นไปได้มากมายในอณูชีววิทยาเทคโนโลยีชีวภาพการแพทย์และด้านอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้อง แอพพลิเคชั่นที่โดดเด่นที่สุดมีดังต่อไปนี้

การวิเคราะห์ทางพันธุกรรม

แอปพลิเคชันแรกเกี่ยวข้องโดยตรงกับห้องปฏิบัติการอณูชีววิทยา เทคโนโลยีรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอช่วยให้นักวิจัยเข้าใจการทำงานปกติของยีนและโปรตีนที่สร้างขึ้นสามารถนำไปใช้ในการวิจัยเพิ่มเติมได้

อุตสาหกรรมยา

โปรตีนที่ผลิตโดยใช้กระบวนการรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอมีการประยุกต์ใช้ในทางการแพทย์ ตัวอย่างที่เกี่ยวข้องสองตัวอย่างในสาขานี้คืออินซูลินของมนุษย์และฮอร์โมนการเจริญเติบโตซึ่งใช้กับผู้ป่วยที่ขาดโปรตีนนี้

ด้วยรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอโปรตีนเหล่านี้สามารถสร้างขึ้นได้โดยไม่จำเป็นต้องแยกออกจากมนุษย์คนอื่นซึ่งแสดงถึงภาวะแทรกซ้อนทางระเบียบวิธีเพิ่มเติมและความเสี่ยงต่อสุขภาพ สิ่งนี้ได้ช่วยปรับปรุงคุณภาพชีวิตของผู้ป่วยนับไม่ถ้วน

อ้างอิง

1. Baca, LEL, & Álvarez, CLC (2015) ชีววิทยา 2. กรุปโปบรรณาธิการ Patria
2. Cooper, GM, Hausman, RE, & Hausman, RE (2000) เซลล์: วิธีการทางโมเลกุล (ฉบับที่ 10) วอชิงตันดีซี: ASM press
3. Devlin, TM (2004) ชีวเคมี: ตำราที่มีการใช้งานทางคลินิก ฉันย้อนกลับ
4. Khan, S. , Ullah, MW, Siddique, R. , Nabi, G. , Manan, S. , Yousaf, M. , & Hou, H. (2016). บทบาทของเทคโนโลยี DNA ที่เกิดใหม่เพื่อปรับปรุงชีวิต International journal of genomics, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, และ Mindan, P. (1996). กายวิภาคศาสตร์พยาธิวิทยา Elsevier สเปน
6. Tortora, GJ, Funke, BR, & Case, CL (2007). จุลชีววิทยาเบื้องต้น. Panamerican Medical Ed.
7. ที่, MJ (1989). อินซูลินของมนุษย์: ยาตัวแรกของเทคโนโลยีดีเอ็นเอ American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11