DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE): ลักษณะ, เหตุผล, การใช้งาน - เคมี

DAPI (4' 6 diamidino-2-phenylindole)เป็นสีย้อมโดยคุณสมบัติเรืองแสงทำหน้าที่เป็น เครื่องหมายใช้กันอย่างแพร่หลายในศิลปะของการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงหรือโฟอื่น ๆ ในกลุ่ม การเรืองแสงที่เปล่งออกมาเป็นสีฟ้าสดใสการกระตุ้นเกิดขึ้นระหว่าง 455-461 นาโนเมตร (แสง UV)

สีย้อม DAPI สามารถผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ของเซลล์ที่ตายแล้วได้อย่างง่ายดาย นอกจากนี้ยังสามารถเปื้อนนิวเคลียสของเซลล์สิ่งมีชีวิตได้ แต่ในกรณีนี้ความเข้มข้นของสิ่งนี้จะต้องสูงขึ้น

โครงสร้างทางเคมีของสีย้อมเรืองแสง DAPI ที่มา: รูปภาพ: ไฟล์: DAPI.svg เป็นเวอร์ชันเวกเตอร์ของไฟล์นี้ ควรใช้แทนภาพแรสเตอร์นี้เมื่อไม่ด้อยกว่า / Richard Wheeler (Zephyris) แก้ไขภาพ

สีย้อมมีความสามารถในการเข้าถึง DNA ของเซลล์ซึ่งมีความสัมพันธ์เป็นพิเศษโดยมีผลผูกพันกับอะดีนีนและไธมีนที่เป็นฐานไนโตรเจน ด้วยเหตุนี้จึงมีประโยชน์มากในเทคนิคอณูชีววิทยาบางอย่าง

สารประกอบนี้อยู่ในกลุ่มของสีย้อมอินโดลและแสดงให้เห็นว่ามีความไวต่อดีเอ็นเอมากกว่าเอทิเดียมโบรไมด์และโพรพิเดียมไอโอไดด์โดยเฉพาะอย่างยิ่งกับเจลอะกาโรส

การใช้สีย้อมเรืองแสงนี้มีความกว้างมากเนื่องจากมีประโยชน์สำหรับ: ศึกษาการเปลี่ยนแปลงของดีเอ็นเอในกระบวนการอะพอพโทติก (การตายของเซลล์) และดังนั้นการตรวจจับเซลล์ในกระบวนการนี้ สำหรับภาพถ่ายรอยเท้าดีเอ็นเอ (การพิมพ์ภาพถ่ายดีเอ็นเอ); เพื่อศึกษาการปนเปื้อนของแบคทีเรีย หรือเพื่อให้เห็นภาพการแบ่งส่วนนิวเคลียร์

นอกจากนี้ยังถูกใช้ในการศึกษาแถบโครโมโซมในการตรวจหา Mycoplasmas sp DNA ในปฏิสัมพันธ์ระหว่าง DNA กับโปรตีนในการย้อมสีและการนับเซลล์โดยการสร้างภูมิคุ้มกันและแม้กระทั่งสีของละอองเรณูที่โตเต็มที่

ลักษณะเฉพาะ

DAPI เป็นตัวย่อของชื่อทางเคมี (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) สูตรโมเลกุลของมันคือ C ₁₆ H ₁₅ N ₅มีน้ำหนักโมเลกุล 350.3 ใกล้ช่วงแสง UV (345 ถึง 358 นาโนเมตร) การกระตุ้นสูงสุดของ DAPI-DNA complex จะเกิดขึ้นในขณะที่การแผ่รังสีเรืองแสงสูงสุดเกิดขึ้นระหว่าง 455-461 นาโนเมตร

สีย้อมนี้มีลักษณะเป็นผงสีเหลือง แต่โครงสร้างที่มีฟลูออโรฟอร์นี้จะเปล่งแสงสีฟ้าสดใส

เป็นสารประกอบที่ละลายในน้ำอย่างไรก็ตามเพื่อเร่งการละลายของมันสามารถใช้ความร้อนได้ สามารถเจือจางด้วย PBS แต่ไม่ละลายในโดยตรง

เมื่อเตรียมสีย้อมแล้วจะต้องเก็บไว้ในที่มืดนั่นคือได้รับการปกป้องจากแสงที่อุณหภูมิ 2 ถึง 8 ° C (ตู้เย็น) ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้สีย้อมจะคงที่นานกว่า 3 สัปดาห์หรือหลายเดือน

หากได้รับการป้องกันจากแสง แต่ทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้องความคงตัวจะลดลงเหลือ 2 หรือ 3 สัปดาห์ แต่เมื่อสัมผัสกับแสงโดยตรงการเสื่อมสภาพจะเร็วมาก หากคุณต้องการเก็บไว้นานกว่ามากสามารถแช่เย็นที่ -20 ° C โดยกระจายเป็นส่วน ๆ

รากฐาน

การย้อมสีนี้ขึ้นอยู่กับการสร้างสารต่อต้านนิวเคลียร์ในเทคนิคอณูชีววิทยาหลักเช่นโฟลไซโตเมทรีกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงและการย้อมโครโมโซมเมตาเฟสหรือนิวเคลียสระหว่างเฟสเป็นต้น

เทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับความสัมพันธ์ที่ดีที่สีย้อมมีต่อฐานไนโตรเจน (อะดีนีนและไทมีน) ที่มีอยู่ในสารพันธุกรรม (DNA) ในร่องรอง ในขณะที่ระดับไซโตพลาสซึมจะเหลือพื้นหลังน้อยมาก

เมื่อสีย้อมเรืองแสงจับกับบริเวณอะดีนีนและไทมีนของดีเอ็นเอการเรืองแสงจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (มากกว่า 20 เท่า) สีที่เปล่งออกมาเป็นสีฟ้าสดใส โดยเฉพาะอย่างยิ่งไม่มีการปล่อยสารเรืองแสงเมื่อจับกับคู่เบสของ GC (guanine-cytosine)

สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าแม้ว่ามันจะมีความสัมพันธ์กับ RNA แต่ก็ไม่ก่อให้เกิดปัญหาเนื่องจากระดับการปล่อยพลังงานสูงสุดจากโมเลกุลนี้เกิดขึ้นที่ความยาวคลื่นอื่น (500 นาโนเมตร) ซึ่งแตกต่างจาก DNA ซึ่งทำได้ที่ 460 นาโนเมตร นอกจากนี้การเพิ่มขึ้นของการเรืองแสงเมื่อผูกกับ RNA เพียง 20%

DAPI ใช้ในการย้อมเซลล์ที่ตายแล้ว (คงที่) มากกว่าเซลล์ที่มีชีวิตเนื่องจากจำเป็นต้องมีความเข้มข้นของสีย้อมที่สูงกว่ามากในการย้อมสีหลังเนื่องจากเยื่อหุ้มเซลล์สามารถซึมผ่าน DAPI ได้น้อยกว่ามากเมื่อมีชีวิตอยู่

สามารถใช้สีย้อม DAPI ร่วมกับฟลูออรีนสีแดงและสีเขียวเพื่อประสบการณ์หลายสี

ใช้

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) เป็นฟลูออโรฟอร์ที่ยอดเยี่ยมดังนั้นจึงใช้กันอย่างแพร่หลายในเทคนิคต่างๆและเพื่อวัตถุประสงค์ต่างๆ ต่อไปนี้จะอธิบายการใช้ DAPI ในเทคนิคหลัก

Flow cytometry

นักวิจัย Gohde, Schumann และ Zante ในปีพ. ศ. 2521 เป็นคนแรกที่ใช้และเสนอ DAPI เป็นฟลูออโรฟอร์ในเทคนิคโฟลไซโตเมทรีซึ่งประสบความสำเร็จอย่างมากเนื่องจากมีความไวต่อดีเอ็นเอสูงและมีความเข้มสูงในการปล่อยสารเรืองแสง

การใช้ DAPI ในเทคนิคนี้ช่วยให้สามารถศึกษาวัฏจักรของเซลล์ปริมาณของเซลล์และการย้อมสีของเซลล์ที่มีชีวิตและที่ตายแล้ว

แม้ว่าจะมีสารให้สีอื่น ๆ เช่น ethidium bromide, Hoechst oxide, acridine orange และ propidium iodide แต่ DAPI ก็เป็นหนึ่งในสารสีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากสามารถถ่ายแสงได้มากกว่าที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้

สำหรับเทคนิคนี้จำเป็นต้องแก้ไขเซลล์ด้วยเหตุนี้สามารถใช้เอทานอลสัมบูรณ์หรือพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% ได้ ตัวอย่างจะถูกหมุนเหวี่ยงและสารส่วนเหนือจะถูกทิ้งจากนั้นเซลล์จะถูกไฮเดรตโดยการเติมบัฟเฟอร์ PBS 5 มล. เป็นเวลา 15 นาที

ในขณะที่เวลาผ่านไปเตรียมคราบ DAPI ด้วยบัฟเฟอร์การย้อมสี (FOXP3 จาก BioLegend) ที่ความเข้มข้น 3 µM

หมุนเหวี่ยงตัวอย่างทิ้งส่วนเหนือตะกอนแล้วคลุมด้วยสารละลาย DAPI 1 มล. เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง

นำตัวอย่างไปที่โฟลไซโตมิเตอร์ด้วยเลเซอร์ที่เหมาะสม

Flow Microfluorometry

อีกเทคนิคหนึ่งที่ใช้ DAPI คือโฟลไมโครฟลูออรีนร่วมกับฟลูออรีนอื่นที่เรียกว่ามิธรามัยซิน ทั้งสองมีประโยชน์ในการหาปริมาณดีเอ็นเอของคลอโรพลาสต์เป็นรายบุคคล แต่ DAPI เหมาะที่สุดสำหรับการวัดอนุภาคแบคทีเรีย T4

การผสมพันธุ์

เทคนิคนี้โดยทั่วไปใช้หัววัดดีเอ็นเอที่ติดฉลากด้วยสีย้อมเรืองแสงที่สามารถเป็น DAPI ได้

ตัวอย่างต้องได้รับการบำบัดความร้อนเพื่อเปลี่ยนดีเอ็นเอที่มีเกลียวสองเส้นและแปลงเป็นสายเดี่ยวสองเส้น ต่อมาได้รับการผสมพันธ์ด้วยการตรวจสอบดีเอ็นเอที่มีฉลาก DAPI ซึ่งมีลำดับความสนใจ

หลังจากนั้นจะถูกล้างเพื่อกำจัดสิ่งที่ไม่ได้ถูกผสมข้ามความคมชัดจะถูกใช้เพื่อแสดงภาพดีเอ็นเอ กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงช่วยให้สามารถสังเกตหัววัดแบบไฮบริดได้

เทคนิคนี้มีวัตถุประสงค์ในการตรวจหาลำดับที่เฉพาะเจาะจงใน DNA ของโครโมโซมเพื่อให้สามารถวินิจฉัยโรคบางชนิดได้

เทคนิคโมเลกุลไซโตเหล่านี้มีส่วนช่วยอย่างมากในการกำหนดรายละเอียดในการศึกษาคาริโอไทป์ ตัวอย่างเช่นเขาได้แสดงบริเวณที่อุดมไปด้วยคู่พื้นฐานของอะดีโนซีนและไธมีนที่เรียกว่าบริเวณที่แตกต่างกันหรือแถบ DAPI

เทคนิคนี้ใช้กันอย่างแพร่หลายในการศึกษาโครโมโซมและโครมาตินในพืชและสัตว์รวมถึงการวินิจฉัยพยาธิสภาพก่อนคลอดและทางโลหิตวิทยาในมนุษย์

ในเทคนิคนี้ความเข้มข้นของ DAPI ที่แนะนำคือ 150 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตรเป็นเวลา 15 นาที

ควรจัดเก็บสไลด์ที่ประกอบไม่ให้ถูกแสงที่อุณหภูมิ 2-8 องศาเซลเซียส

การย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์

เซลล์ได้รับการแก้ไขด้วยพาราฟอร์มัลดีไฮด์ 4% หากต้องใช้คราบอื่น ๆ DAPI จะถูกทิ้งไว้ที่ส่วนท้ายเป็นคราบและเซลล์จะถูกปกคลุมด้วยสารละลาย PBS เป็นเวลา 15 นาที ในขณะที่เวลาผ่านไปให้เตรียมสารละลาย DAPI โดยเจือจางด้วย PBS เพื่อให้ความเข้มข้นสุดท้ายคือ 300 µM

จากนั้น PBS ส่วนเกินจะถูกลบออกและปิดด้วย DAPI เป็นเวลา 5 นาที ล้างหลาย ๆ ครั้ง สไลด์จะดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสงภายใต้ฟิลเตอร์ที่เหมาะสม

เอกสารความปลอดภัย

สารประกอบนี้ต้องได้รับการจัดการด้วยความระมัดระวังเนื่องจากเป็นสารประกอบที่มีคุณสมบัติในการกลายพันธุ์ ถ่านกัมมันต์ใช้เพื่อกำจัดสารประกอบนี้ออกจากสารละลายที่จะทิ้ง

ต้องใช้ถุงมือเสื้อคลุมและแว่นตานิรภัยเพื่อหลีกเลี่ยงอุบัติเหตุจากน้ำยานี้ หากสัมผัสกับผิวหนังหรือเยื่อบุควรล้างบริเวณนั้นด้วยน้ำให้เพียงพอ

คุณไม่ควรปิเปตน้ำยานี้ทางปากโดยใช้ปิเปต

อย่าปนเปื้อนน้ำยาด้วยสารจุลินทรีย์เพราะจะนำไปสู่ผลลัพธ์ที่ผิดพลาด

อย่าเจือจางคราบ DAPI มากกว่าที่แนะนำเพราะจะทำให้คุณภาพของคราบลดลงอย่างมาก

อย่าให้น้ำยาโดนแสงโดยตรงหรือให้ความอบอุ่นเพราะจะลดการเรืองแสง

อ้างอิง

Brammer S, Toniazzo C และ Poersch L. Corantes มักเกี่ยวข้องกับเซลล์สืบพันธุ์ของพืช Arq Inst. Biol 2015, 82. Available from: scielo.
ห้องปฏิบัติการ Impath DAPI มีจำหน่ายที่: menarinidiagnostics.com/
ห้องปฏิบัติการ Cytocell 2019. คำแนะนำสำหรับการใช้งาน DAPI มีให้ที่ cytocell.com
Elosegi A, Sabater S. แนวคิดและเทคนิคในระบบนิเวศของแม่น้ำ (2009) บรรณาธิการ Rubes, สเปน มีจำหน่ายที่: books.google.co.ve/
Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. การใช้การเรืองแสงในวิธี dissector ที่ปรับเปลี่ยนเพื่อประมาณจำนวน myocytes ในเนื้อเยื่อหัวใจ Arch. บรา. Cardiol 2012; 98 (3): 252-258 มีจำหน่ายจาก: scielo
Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. การปรากฏตัวของไฟโตพลาสมาสในมะละกอ (Carica Papaya) ในเม็กซิโก นิตยสาร Chapingo ชุดพืชสวน, 2554; 17 (1), 47-50. มีจำหน่ายที่: scielo.org

DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-PHENYLINDOLE): ลักษณะ, เหตุผล, การใช้งาน - เคมี - 2026