น้ำซุปยูเรีย: รากฐานการเตรียมและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2025

น้ำซุปยูเรียเป็นสื่อวัฒนธรรมของเหลวที่ใช้ในการตรวจสอบสถานะของเอนไซม์ urease ในจุลชีพบางอย่าง ยูรีเอสเป็นเอนไซม์จุลินทรีย์ที่ผลิตในลักษณะที่เป็นส่วนประกอบกล่าวคือสังเคราะห์ขึ้นโดยไม่คำนึงว่าสารตั้งต้นที่ทำหน้าที่นั้นมีอยู่หรือไม่ก็ตาม

หน้าที่ของยูรีเอสเกี่ยวข้องกับการสลายตัวของสารประกอบอินทรีย์ จุลินทรีย์บางชนิดไม่สามารถสังเคราะห์เอนไซม์นี้ได้ดังนั้นการกำหนดในห้องปฏิบัติการจึงช่วยให้สามารถระบุสายพันธุ์ของแบคทีเรียบางชนิดและแม้แต่แยกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ในสกุลเดียวกัน

การทดสอบยูเรียเชิงลบและเชิงบวก ที่มา: ภาพถ่ายโดยผู้เขียน MSc. Marielsa Gil.

การทดสอบยูเรียมีสองประเภท: Stuart และ Christensen พวกเขาแตกต่างกันในองค์ประกอบและความไว ประการแรกเป็นพิเศษในการแสดงยูเรียสจำนวนมากที่ผลิตโดยสายพันธุ์ Proteus

ประการที่สองมีความไวมากกว่าและสามารถตรวจจับยูเรียสในปริมาณเล็กน้อยที่สร้างขึ้นในช่วงปลายของเชื้อแบคทีเรียอื่น ๆ เช่น Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter และ Mycobacterium

น้ำซุปยูเรียของ Stuart ประกอบด้วย Urea, Sodium Chloride, Dipotassium Phosphate, Monopotassium Phosphate, Yeast Extract, Phenol Red และ Distilled Water

ในขณะเดียวกันน้ำซุปหรือวุ้นยูเรียของคริสเตนเซนประกอบด้วยเปปโตนโซเดียมคลอไรด์โมโนโปแตสเซียมฟอสเฟตกลูโคสยูเรียฟีนอลเรดน้ำกลั่นและวุ้น หลังก็ต่อเมื่อเป็นตัวกลางที่เป็นของแข็ง

รากฐาน

เอนไซม์ยูรีเอสไฮโดรไลซ์ยูเรียให้กลายเป็นก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์น้ำและแอมโมเนียสองโมเลกุล สารประกอบเหล่านี้ทำปฏิกิริยาเพื่อสร้างผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่เรียกว่าแอมโมเนียมคาร์บอเนต

น้ำซุป Urea ของ Stuart

น้ำซุปยูเรียของ Stuart มีบัฟเฟอร์มากกว่าโดยมี pH 6.8 ดังนั้นจุลินทรีย์จะต้องสามารถสร้างแอมโมเนียจำนวนมากเพื่อเปลี่ยนฟีนอลสีแดง pH ควรสูงกว่า 8

ดังนั้นน้ำซุปยูเรียของ Stuart จึงถูกคัดเลือกสำหรับสายพันธุ์ Proteus โดยให้ผลลัพธ์ที่เป็นบวกภายใน 24 ถึง 48 ชั่วโมงของการฟักตัวและไม่ได้ผลสำหรับแบคทีเรียที่สร้างยูเรียในปริมาณต่ำหรือที่ไฮโดรไลซ์ยูเรียอย่างช้าๆ

ทั้งนี้เนื่องจากสายพันธุ์ Proteus สามารถใช้ยูเรียเป็นแหล่งไนโตรเจนได้ แบคทีเรียที่สร้างยูรีเอสอื่น ๆ กลับต้องการแหล่งเพิ่มเติม

อย่างไรก็ตามPérez et al. (2002) ระบุว่าน้ำซุปยูเรียของ Stuart มีประสิทธิภาพเทียบเท่ากับวุ้นยูเรียของ Christensen ในการตรวจหายูเรียสในสายพันธุ์ยีสต์ของ Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon และ Saccharomyces

ผู้เขียนศึกษาอ้างว่าบรรลุข้อตกลง 100% กับสื่อทั้งสอง (Stuart และ Christensen) เมื่อฟักตัวเป็นเวลา 24 และ 48 ชั่วโมง ยกเว้นว่าสายพันธุ์ที่สามารถเปลี่ยนสื่อให้เป็นสีชมพูบานเย็นที่แข็งแกร่งจะถูกมองว่าเป็นบวก

การชี้แจงนี้เป็นสิ่งที่จำเป็นเนื่องจาก Lodder (1970) ระบุว่ายีสต์เกือบทั้งหมดสามารถเปลี่ยนมุมของวุ้นของ Christensen urea ให้เป็นสีชมพูอ่อนได้ เนื่องจากสามารถไฮโดรไลซ์ยูเรียได้ในปริมาณที่น้อยที่สุดและการก่อตัวของเอมีนโดยการดีคาร์บอกซิเลชันออกซิเดชั่นของกรดอะมิโนบนพื้นผิว สิ่งนี้ไม่ควรตีความว่าเป็นบวก

Urea Agar หรือ Broth ของ Christensen

น้ำซุปยูเรียหรือวุ้นของ Christensen มีบัฟเฟอร์น้อยกว่าสามารถตรวจจับแอมโมเนียได้ในปริมาณเล็กน้อย นอกจากนี้สื่อนี้ยังอุดมไปด้วยเปปโตนและกลูโคส สารประกอบเหล่านี้ทำให้จุลินทรีย์ที่สร้างยูรีเอสอื่น ๆ เติบโตซึ่งไม่เติบโตในน้ำซุปสจวร์ต

ในทำนองเดียวกันการทดสอบยูเรียของ Christensen ให้ผลลัพธ์ที่เร็วกว่าโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ Proteus สามารถให้ผลบวกอย่างมากในเวลาเพียง 30 นาทีเป็นเวลาต่ำสุดและสูงสุด 6 ชั่วโมงเป็นเวลาสูงสุด

จุลินทรีย์ที่สร้างยูรีเอสที่เหลือจะเปลี่ยนสีของตัวกลางเล็กน้อยหลังจาก 6 ชั่วโมงและรุนแรงหลังจาก 24, 48, 72 ชั่วโมงขึ้นไปและแม้แต่บางสายพันธุ์ก็สามารถให้ปฏิกิริยาที่อ่อนแอได้หลังจาก 5 หรือ 6 วัน

การสื่อความหมายของทั้งสองสื่อ (Stuart และ Christensen)

ตัวกลางเดิมมีสีเหลืองส้มและปฏิกิริยาเชิงบวกจะเปลี่ยนสีของตัวกลางเป็นสีชมพูบานเย็น ความเข้มของสีเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณแอมโมเนียที่ผลิตได้

ปฏิกิริยาเชิงลบจะทิ้งสีกลางของสีเดิมไว้ยกเว้นยีสต์ซึ่งอาจเปลี่ยนเป็นสีชมพูอ่อนด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อยูเรียของ Christensen

การจัดเตรียม

น้ำซุป Urea ของ Stuart

ชั่งน้ำหนักกรัมที่จำเป็นตามข้อบ่งชี้ของ บริษัท การค้า ละลายในน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อโดยเฉพาะอย่างยิ่ง อย่าใช้ความร้อนในการละลายเนื่องจากยูเรียมีความไวต่อความร้อน

การกรองเมมเบรนใช้ในการฆ่าเชื้อ สำหรับสิ่งนี้จะใช้ฟิลเตอร์ Millipore ที่มีรูพรุน 0.45 µ อย่าใช้หม้อนึ่ง เมื่อกรองสารละลายแล้วจะกระจายลงในหลอดที่ปราศจากเชื้อ เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้ควรถ่ายโอนระหว่าง 1.5 มล. เป็นปริมาณขั้นต่ำและ 3 มล. เป็นปริมาณสูงสุดต่อหลอด

เก็บในตู้เย็นและอุ่นก่อนใช้

หากไม่มีวิธีการกรองควรใช้ตัวกลางทันทีเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่เชื่อถือได้

อีกวิธีหนึ่งในการเตรียม Urea Broth ของ Stuart มีดังนี้:

อาคารพาณิชย์บางแห่งขายสื่อกลางสำหรับการทดสอบยูเรียโดยไม่รวมยูเรีย

มีการชั่งน้ำหนักปริมาณที่ระบุโดย บริษัท การค้า ละลายในน้ำกลั่นและฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งความดัน 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที พักไว้เล็กน้อยและเมื่อตัวกลางอุ่นให้เติมสารละลายยูเรีย 100 มล. ที่เตรียมไว้ 20% และฆ่าเชื้อโดยการกรอง

กระจายในหลอดที่ปราศจากเชื้อตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

Urea Agar หรือ Broth ของ Christensen

- การเตรียมสารละลายยูเรีย

ชั่งยูเรียที่ขาดน้ำ 29 กรัมแล้วละลายในน้ำกลั่น 100 มล. ใช้วิธีกรองเพื่อฆ่าเชื้อ อย่านึ่ง.

- วุ้นฐานยูเรีย

ละลายวุ้นพื้นฐานที่ขาดน้ำ 24 กรัมในน้ำกลั่น 950 มล. ฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งที่อุณหภูมิ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที พักไว้จนกว่าจะถึงอุณหภูมิ 50 ° C แล้วเติมยูเรียที่เตรียมไว้ก่อนหน้านี้โดยปลอดเชื้อ

เท 4-5 มล. ลงในหลอดที่ปราศจากเชื้อแล้วเอียงจนแข็ง ควรมีจะงอยปากแบบขลุ่ยยาว

สื่อนี้สามารถเตรียมในรูปของเหลวได้เช่นกัน

การประยุกต์ใช้งาน

การทดสอบยูเรียมีประสิทธิภาพอย่างมากในการแยกแยะสกุล Proteus จากสกุลอื่น ๆ ใน Family Enterobacteriaceae เนื่องจาก Proteus มีปฏิกิริยาอย่างรวดเร็ว

การใช้องค์ประกอบของคริสเตนเซนช่วยให้สามารถแยกความแตกต่างระหว่างสิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันได้ ตัวอย่างเช่น S. haemolyticus และ S. Warneri เป็น coagulase-negative และ beta-hemolytic Staphylococcus แต่แตกต่างกันตรงที่ S. haemolyticus เป็นยูเรียลบและ S. Warneri เป็นยูเรียบวก

ในทางกลับกัน McNulty ประสบความสำเร็จในการใช้น้ำซุปยูเรีย 2% ของ Christensen เพื่อศึกษาการปรากฏตัวของ Helicobacter pylori ในตัวอย่างชิ้นเนื้อที่นำมาจากเยื่อเมือกในกระเพาะอาหาร (บริเวณแอนตร้า)

การปรากฏตัวของ H. pylori เป็นหลักฐานจากการทดสอบยูเรียในเชิงบวก ระยะเวลาในการสังเกตผลลัพธ์เป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณจุลินทรีย์ที่มีอยู่

ดังจะเห็นได้ว่าเป็นวิธีง่ายๆในการวินิจฉัย Helicobacter pylori ในการตรวจชิ้นเนื้อในกระเพาะอาหาร

สุดท้ายการทดสอบนี้ยังมีประโยชน์สำหรับการแยกสายพันธุ์จากจำพวก Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus และ Mycobacteria

การทดสอบปุ๋ยยูเรีย

ทั้งสองวิธีต้องใช้หัวเชื้อจุลินทรีย์ที่แข็งแกร่งเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด อาณานิคมของแบคทีเรียควรนำมาจากวุ้นในเลือดและยีสต์จาก Sabouraud agar โดยมีข้อยกเว้นบางประการ หัวเชื้อถูกทำให้เป็นอิมัลชันในตัวกลางที่เป็นของเหลว

สำหรับน้ำซุปยูเรียของ Stuart ให้บ่มที่อุณหภูมิ 37 ºCเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมงโดยรู้ว่าคุณกำลังมองหาสายพันธุ์ของ Proteus เท่านั้นเมื่อสายพันธุ์เป็นแบคทีเรีย สำหรับยีสต์สามารถบ่มที่อุณหภูมิ 37 ° C หรือที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมงในการฟักตัว

ในกรณีของน้ำซุปยูเรียของ Christensen นั้นจะถูกบ่มที่อุณหภูมิ37ºCเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หากผลการทดสอบเป็นลบจะสามารถบ่มได้นานถึง 6 วัน หากผลการทดสอบเป็นบวกก่อน 6 ชั่วโมงแสดงว่าเป็นสายพันธุ์ของโปรติอุส

ในกรณีของวุ้นยูเรียของคริสเตนเซนวุ้นจะได้รับการฉีดวัคซีนอย่างมากโดยไม่ต้องเจาะรู น้ำซุปถูกบ่มและตีความไปในทางเดียวกัน

ระบบประกันคุณภาพ

สามารถใช้สายพันธุ์ควบคุมเช่น Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 และ Salmonella typhimurium เพื่อทดสอบตัวกลาง สองรายการแรกควรให้ผลลัพธ์ที่เป็นบวกและผลลัพธ์เชิงลบสองรายการสุดท้าย

ที่มา: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004) การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา 5th ed. กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina

อ้างอิง

1. Pérez C, Goitía K. , Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. การใช้น้ำซุปยูเรียของสจวร์ตสำหรับการทดสอบยูเรียสเป็นการทดสอบในการวินิจฉัยยีสต์ รายได้ Soc. Ven. Microbiol ปี 2002 22 (2): 136-140. มีจำหน่ายที่: Scielo.org
2. Mac Faddin J. (2003). การทดสอบทางชีวเคมีเพื่อระบุแบคทีเรียที่มีความสำคัญทางคลินิก 3rd ed. กองบรรณาธิการ Panamericana บัวโนสไอเรส. อาร์เจนตินา.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา 5th ed. กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
5. Britannia Laboratories Christensen Medium (ฐานวุ้นยูเรีย) 2015 มีจำหน่ายที่: britanialab.com