ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS): เหตุผลการเตรียมและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2026

ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ฟอสเฟต Buffered น้ำเกลือหรือ BPSเป็นบัฟเฟอร์ isotonic ซึ่งมีฟังก์ชั่น ที่จะ รักษาความเป็นกรดและแรงดันใกล้เคียงกับสภาพแวดล้อมทางชีวภาพจากธรรมชาติ (สรีรวิทยา) คำย่อ PBS ย่อมาจากน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต

pH และ osmolarity เป็นสองประเด็นสำคัญที่ต้องได้รับการควบคุมในโปรโตคอลของห้องปฏิบัติการบางอย่าง ในกรณีของ pH จำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องมีการควบคุมโดยเฉพาะอย่างยิ่งในปฏิกิริยาทางชีวเคมีเนื่องจากสิ่งเหล่านี้อาจแตกต่างกันไปหรือไม่สามารถดำเนินการได้หากสารตั้งต้นมีค่า pH ที่ไม่เหมาะสม

PBS ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือที่ pH ต่างกันสองค่า ที่มา: Pixinio.com

ในขณะเดียวกันการควบคุมออสโมลาริตีเป็นสิ่งสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อทำงานกับเซลล์ที่มีชีวิตเนื่องจากเยื่อพลาสมาของเซลล์ทำปฏิกิริยาตามความเข้มข้นของตัวถูกละลายที่พบ

ถ้าเซลล์ถูกถ่ายโอนไปยังตัวกลางที่มีความเข้มข้นสูงเซลล์เหล่านี้จะถูกทำให้ขาดน้ำเนื่องจากการไล่ระดับสีของน้ำจะถูกส่งไปยังด้านที่มีความเข้มข้นของตัวถูกละลายสูง ในทางกลับกันถ้าเซลล์ถูกวางไว้ในตัวกลางที่มีไฮโปโทนิกเซลล์จะดูดซับของเหลวจนเหลว

นั่นคือเหตุผลที่ใช้บัฟเฟอร์ PBS สำหรับโปรโตคอลในห้องปฏิบัติการที่ต้องการการบำรุงรักษาเซลล์ในหลอดทดลองด้วยวิธีนี้เซลล์จะไม่เสียหาย

PBS ประกอบด้วยเกลือหลายชนิดเช่นโซเดียมคลอไรด์โซเดียมฟอสเฟตโพแทสเซียมคลอไรด์และโพแทสเซียมฟอสเฟต องค์ประกอบของ PBS อาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับโปรโตคอล

รากฐาน

โดยทั่วไปหน้าที่ของบัฟเฟอร์ฟอสเฟตคือการรักษา pH ทางสรีรวิทยาให้คงที่พร้อมกับความเข้มข้นของอิเล็กโทรไลต์ที่คล้ายกับที่พบในร่างกาย

ในสภาพแวดล้อมนี้เซลล์สามารถคงตัวอยู่ได้เนื่องจากมีการจำลองสภาวะทางสรีรวิทยาให้ได้มากที่สุด

สามารถเพิ่มสารประกอบอื่น ๆ ลงในสูตร PBS ดั้งเดิมได้หากจำเป็นตัวอย่างเช่นการเติม EDTA ลงในบัฟเฟอร์จะมีประโยชน์ในการล้างเซลล์เม็ดเลือดแดงในการทดสอบความไม่ลงรอยกัน

EDTA ป้องกันไม่ให้เศษของส่วนเสริม C1 ที่มีอยู่ในซีรั่มถูกแยกออกและเกาะติดกับเซลล์เม็ดเลือดแดงนั่นคือหลีกเลี่ยงผลลัพธ์ที่ไม่ลงรอยกันที่ผิดพลาด นอกจากนี้ EDTA ยังช่วยในการแยกเซลล์

การจัดเตรียม

ปริมาณเกลือที่ต้องชั่งน้ำหนักสำหรับการเตรียม PBS phosphate buffered saline จะขึ้นอยู่กับปริมาณที่ต้องเตรียม:

- สารละลายสต็อกน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (10X PBS)

สำหรับสารละลายหนึ่งลิตร:

ในการชั่งน้ำหนัก:

NaCl 80.6 กรัม

KCl 2.2 กรัม

11.5 กรัมของนา₂ HPO ₄ ,

2.0 ก. KH ₂ HPO ₄

เทคนิคการเตรียม

ใส่เกลือที่มีน้ำหนักมากลงในบีกเกอร์เติมน้ำให้เพียงพอ (80%) และผสมกับแท่งแม่เหล็กบนจานกวนจนเกลือละลาย

การเตรียม PBS โดยใช้จานกวนพร้อมแท่งแม่เหล็ก ที่มา: ผู้ใช้: Ruhrfisch, Wikipedia ดอทคอม

กรองเพื่อขจัดอนุภาคที่ไม่ละลายน้ำ ใช้ฟิลเตอร์ที่มีรูพรุน 0.45 µm นึ่งและแจกจ่ายแบบปลอดเชื้อในเครื่องดูดควันแบบเคลือบลงในขวดแก้วที่มีฝาปิด

สารละลาย 10X (เข้มข้น) ไม่ปรับ pH การปรับจะทำเมื่อเจือจางถึงความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ 1X PBS (เจือจาง 1:10)

- เกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (1X PBS)

สามารถเตรียม 1X PBS ได้โดยตรงโดยการชั่งน้ำหนักในปริมาณที่สอดคล้องกันของเกลือแต่ละชนิดหรือเตรียมได้โดยการเจือจางสารละลายสต็อก (1:10) ด้วยน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อ

- ในการเตรียมน้ำเกลือบัฟเฟอร์ 1X PBS ฟอสเฟตโดยตรงหนึ่งลิตรให้ชั่งน้ำหนัก:

NaCl 8.06 กรัม

KCl 0.22 กรัม

1.15 กรัมของนา₂ HPO ₄ ,

0.20 กรัมของ KH ₂ HPO ₄

เทคนิคการเตรียม

ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในสารละลายเข้มข้น ต่อจากนั้นต้องปรับ pH ในการวัดค่า pH และขึ้นอยู่กับผลลัพธ์ให้ใช้กรด (HCl) หรือเบส (NaOH) เพื่อลดหรือเพิ่ม pH ตามลำดับตามความจำเป็นจนกว่าจะถึง 7.4

กรดหรือเบสจะถูกเติมทีละหยดในขณะที่ตรวจสอบค่า pH ของสารละลายโดยใช้เครื่องวัด pH กรองนึ่งและกระจายแบบปลอดเชื้อลงในหลอดหรือขวดทรงกรวยตามต้องการ

- ในการเตรียม 1X PBS จากโซลูชันหุ้น 10X:

ทำการเจือจาง 1:10 ตัวอย่างเช่นในการเตรียม 1X PBS 1 ลิตรตวงสารละลายสต็อก 100 มล. และเติมน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ 700 มล. ปรับ pH และเติมน้ำได้มากถึง 1,000 มล.

บัฟเฟอร์ PBS ที่เตรียมไว้ไม่มีสีและชัดเจน

PBS รายวันสามารถเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องและส่วนที่เหลือในตู้เย็น

โซลูชั่นสำหรับการปรับ pH

HCl

สำหรับ 100 มล. ของ 1 โมลาร์ HCL (กรดไฮโดรคลอริก)

ตวงน้ำกลั่น 91 มล. แล้วใส่ในบีกเกอร์ 250 มล.

วัด HCl เข้มข้น 8.62 มล. แล้วค่อยๆเติมลงในบีกเกอร์ที่มีน้ำอยู่ (อย่าทำแบบอื่น) ใช้มาตรการความปลอดภัยทางชีวภาพที่เหมาะสมเมื่อจัดการกับกรดแก่ (สารที่มีฤทธิ์กัดกร่อนสูง)

ผสมเป็นเวลา 5 นาทีโดยควรใช้จานกวนที่มีแท่งแม่เหล็กอยู่ในแก้ว เทลงในขวดขนาด 100 มล. และบรรจุได้ถึง 100 มล. ด้วย H ₂ O ที่กลั่นแล้ว

NaOH

สำหรับ NaOH 100 มล. (โซเดียมไฮดรอกไซด์) 10 โมลาร์

ตวงน้ำกลั่น 40 มล. แล้วใส่ในบีกเกอร์ 250 มล. ตวง NaOH 40 กรัมแล้วเติมน้ำ ผสมโดยใช้จานกวนที่มีแท่งแม่เหล็กอยู่ด้านในแก้ว

โอนไปยังขวดปริมาตร 100 มล. และทำเครื่องหมายด้วยน้ำกลั่น ปฏิบัติตามข้อบังคับด้านความปลอดภัยทางชีวภาพเนื่องจากปฏิกิริยานี้คายความร้อน (จะปล่อยพลังงานออกมาในรูปของความร้อน)

หากคุณต้องการเตรียมน้ำเกลือฟอสเฟตในปริมาณอื่น ๆ คุณสามารถดูตารางต่อไปนี้:

ที่มา: « Laboratory of Viral and Human Genomics, UASLP School of Medicine »

การประยุกต์ใช้งาน

ส่วนใหญ่จะใช้ในชีววิทยาของเซลล์ภูมิคุ้มกันวิทยาภูมิคุ้มกันวิทยาแบคทีเรียไวรัสวิทยาและห้องปฏิบัติการวิจัย

เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการล้างเซลล์โดยการหมุนเหวี่ยง (เซลล์เม็ดเลือดแดง) การล้างเซลล์โมโนเลย์ในเทคนิควงรีสเปกโตรสโคปิกในการหาปริมาณของไบโอฟิล์มของแบคทีเรียในการบำรุงรักษาเซลล์เพาะเลี้ยงไวรัสเพื่อเป็นน้ำยาล้างในเทคนิคการสร้างภูมิคุ้มกันทางอ้อม และในเทคนิคการศึกษาลักษณะของโมโนโคลนอลแอนติบอดี

นอกจากนี้ยังใช้ในการขนส่งเซลล์หรือเนื้อเยื่อเป็นตัวเจือจางสำหรับการนับเซลล์การเตรียมเอนไซม์เซลล์ (ทริปซิน) เป็นตัวเจือจางสำหรับวิธีการผึ่งให้แห้งทางชีวโมเลกุลและเพื่อเตรียมสารทำปฏิกิริยาอื่น ๆ

ในทางกลับกันมาร์ตินและคณะในปี 2549 แสดงให้เห็นว่า PBS มีประโยชน์ในห้องปฏิบัติการทางนิติวิทยาศาสตร์โดยเฉพาะในการฟื้นตัวของอสุจิจากรอยเปื้อนในช่องคลอดหรือในการฟื้นตัวของเซลล์ในช่องคลอดจากรอยเปื้อนของอวัยวะเพศชาย ด้วยวิธีนี้สามารถกำหนดได้หากมีความสัมพันธ์ทางเพศ

ข้อ จำกัด

- บัฟเฟอร์ของ PBS บางชนิดมีสารที่เรียกว่าโซเดียมเอไซด์เป็นสารกันบูด สารประกอบนี้สามารถสร้างสารระเบิดได้หากสัมผัสกับตะกั่วหรือทองแดง ด้วยเหตุนี้จึงต้องใช้ความระมัดระวังเป็นพิเศษเมื่อทิ้งน้ำยานี้ลงท่อระบายน้ำ หากทิ้งด้วยวิธีนี้จะต้องเติมน้ำปริมาณมากเพื่อเจือจางให้ได้มากที่สุด

- ไม่ควรเติมสังกะสีลงในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตเนื่องจากจะทำให้เกลือบางส่วนตกตะกอน

-Wangen et al. ในปี 2018 พบว่าการใช้ PBS ไม่เหมาะสำหรับการล้างเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันชนิดไมอีลอยด์ (AML) ที่สกัดจากเลือดส่วนปลายเนื่องจากเซลล์จำนวนมากสูญเสียไปจากการสลายโดยมีวัสดุลดลงอย่างมาก โปรตีน.

ดังนั้นพวกเขาจึงพิจารณาว่าไม่ควรล้างเซลล์ AML หลักด้วย PBS หลังจากเก็บในไนโตรเจนเหลว

อ้างอิง

1. Coll J. (1993). เทคนิคการวินิจฉัยทางไวรัสวิทยา. Ed Díaz de Santos 360 หน้า
2. Rodríguez M, Ortiz T. การเพาะเลี้ยงเซลล์ เปลี่ยนสื่อ ภาควิชาเซลล์วิทยาและจุลพยาธิวิทยาปกติและพยาธิวิทยามหาวิทยาลัยเซวิลล์ มีจำหน่ายที่ personal.us.es
3. การเตรียมน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) (2008) ขั้นตอนการปฏิบัติงานมาตรฐาน (SOP) ห้องปฏิบัติการจีโนมิกส์ของมนุษย์และไวรัส UASLP School of Medicine มีจำหน่ายที่: genomica.uaslp.mx
4. "ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ" Wikipedia สารานุกรมเสรี 3 เม.ย. 2019, 19:36 UTC. 13 เม.ย. 2019, 02:57 น. th.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. หัวข้อในชีวฟิสิกส์ระดับโมเลกุล. มีให้ที่: users.df.uba.ar
6. Rediar คู่มือ. PBS + EDTA มีจำหน่ายที่: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG การใช้น้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟตในการฟื้นฟูเซลล์และตัวอสุจิจากไม้กวาด วิทย์ยุติธรรม. 2006 46 (3): 179-84. มีให้ใน: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A และอื่น ๆ วิธีการถนอมอาหารและการล้างน้ำเกลือแบบบัฟเฟอร์ฟอสเฟตมีผลต่อโปรตีนมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเฉียบพลันชนิดไมอีลอยด์ Int J Mol วิทย์. 2018; 19 (1): 296. มีให้ใน: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). พื้นฐานทางทฤษฎีและปฏิบัติของฮิสโทเคมี สภาที่เหนือกว่าของการสืบสวนทางวิทยาศาสตร์ กรุงมาดริด มีจำหน่ายที่: books.google.co.ve