BIURET: เหตุผลรีเอเจนต์ขั้นตอนการใช้งาน - ชีววิทยา - 2024

biuretเป็นน้ำยาที่ใช้สำหรับการกำหนดโปรตีนสายยาวและสายสั้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งใช้ในสาขาเคมีวิเคราะห์และการวิเคราะห์ปัสสาวะเพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดในซีรัมพลาสมาและปัสสาวะ

ค่าโปรตีนสามารถเพิ่มหรือลดได้ในบางโรค อาการ Hypoproteinemia มักเกิดในผู้ป่วยโรคไตผู้ป่วยที่ขาดสารอาหารและในผู้ป่วยที่ติดเชื้อเรื้อรัง

โครงสร้างทางเคมีของคอมเพล็กซ์ที่เกิดขึ้นในการทดสอบ Biuret เชิงบวกของปฏิกิริยา Biuret ที่มา: Yikrazuul / flickr

แม้ว่าภาวะไขมันในเลือดสูงจะพบได้ในพยาธิสภาพเช่น multiple myeloma, systemic lupus erythematosus, เยื่อบุหัวใจอักเสบจากแบคทีเรีย, เยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อแบคทีเรีย, macroglobulinemia ของ Waldenstrom และอื่น ๆ

ในทางกลับกันการมีโปรตีนในปัสสาวะเกิดจากการกรองของอัลบูมินโดยไต นี่คือพฤติกรรมทางพยาธิวิทยาที่ต้องศึกษา

ในแง่นี้ Biuret มีประโยชน์มากเนื่องจากช่วยให้สามารถระบุปริมาณโปรตีนในซีรัมพลาสมาปัสสาวะและตัวอย่างอื่น ๆ อีกมากมาย

แม้แต่ Biuret ยังสามารถใช้เพื่อตรวจสอบการมีอยู่และความเข้มข้นของโปรตีนในตัวอย่างที่สำรวจไม่ดีหรือตัวอย่างขององค์ประกอบที่ไม่รู้จัก ดังนั้นจึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในพื้นที่การวิจัย

การทดสอบ Biuret ขึ้นอยู่กับการตรวจจับพันธะเปปไทด์ การทดสอบจะเกิดขึ้นในตัวกลางที่เป็นด่าง ตัวอย่างต้องมีพันธะเปปไทด์อย่างน้อยสองพันธะเพื่อให้เกิดสารประกอบเชิงซ้อนสีม่วงม่วง คอมเพล็กซ์เกิดจากการรวมกันของพันธะและไอออนทองแดง

รากฐาน

น้ำยาของ Biuret ประกอบด้วยโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์คิวพริกซัลเฟตและโซเดียมและโพแทสเซียมทาร์เทรต โซเดียมไฮดรอกไซด์ใช้ในการทำให้ตัวกลางเป็นด่างเนื่องจากเงื่อนไขนี้จำเป็นสำหรับปฏิกิริยาที่จะเกิดขึ้น

สารที่ทำปฏิกิริยากับโปรตีนคือ cupric sulfate ในขณะที่โซเดียมทาร์เทรตมีหน้าที่ไม่อนุญาตให้สร้างคอปเปอร์ไฮดรอกไซด์ซึ่งมีแนวโน้มที่จะตกตะกอนและขัดขวางปฏิกิริยา

หากพบสารที่มีพันธะเปปไทด์ (โพลีเปปไทด์หรือโปรตีน) ในตัวอย่างการทดสอบจะเป็นบวก

ปฏิกิริยาจะถูกตีความว่าเป็นบวกเมื่อสารละลายเปลี่ยนเป็นสีม่วง สีเกิดจากการก่อตัวของสารประกอบเชิงซ้อนระหว่างพันธะเปปไทด์อย่างน้อยสองพันธะที่มีหมู่ CO-NH และไอออนบวกคิวพริก

คอมเพล็กซ์ไวโอเล็ตสามารถเกิดขึ้นได้สองวิธี: หนึ่งเกิดจากการสูญเสียโปรตอนจากกลุ่มเอไมด์ที่จับกับโลหะ (ดีโพรโนเตชั่น) และอื่น ๆ โดยการรวมตัวกันของอิเล็กตรอนออกซิเจนและไนโตรเจนซึ่งเป็นอิสระและจับกัน ด้วยทองแดง

ปฏิกิริยานี้อาจมีความเข้มและสีแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับชนิดของโปรตีน

การทดสอบสามารถทำได้ในเชิงคุณภาพหรือเชิงปริมาณ ในรูปแบบเชิงคุณภาพจะรายงานว่าเป็นบวกหรือลบ ในขณะที่อยู่ในรูปแบบเชิงปริมาณความเข้มข้นสามารถวัดได้ด้วยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริก

ปฏิกิริยาจะอ่านได้ระหว่าง 540-560 นาโนเมตร ความเข้มของสีเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้นของพันธะเปปไทด์ในตัวอย่าง

รีเอเจนต์

-20% โซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH)

-Cupric sulfate เพนทาไฮเดรต 1% (CuSO _4. 5H ₂ O)

- ผสมโซเดียมและโพแทสเซียมทาร์เทรตเตตระไฮเดรต (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

ความเสถียรของน้ำยาไบยูรี

- ต้องเก็บในตู้เย็น

กระบวนการ

เทคนิค

- วางตัวอย่างหรือมาตรฐาน 100 µl ที่จะวิเคราะห์ในหลอดทดลอง

- เติมโซเดียมไฮดรอกไซด์ 2 มล.

- ผสมได้ดีมาก

- เติมน้ำยาบิยูเรต 5 มล.

- ผสมและพักไว้ 25 นาทีที่อุณหภูมิห้องปิดฝาและป้องกันแสง

- สังเกตการก่อตัวหรือไม่ของสีและวัดสเปกโตรโฟโตเมตริก

เส้นโค้งการสอบเทียบ

Bovine serum albumin สามารถใช้เป็นมาตรฐานในการปรับเทียบเส้นโค้ง ความเข้มข้นต่างๆเตรียมจากมัน ตัวอย่างเช่น 25, 50, 75, 100, 125 และ 150%

ปฏิกิริยาถูกตั้งค่าด้วยความเข้มข้นที่ทราบทั้งหมดนี้และค่าการดูดซับจะถูกอ่านที่ความยาวคลื่น 540 นาโนเมตร ด้วยข้อมูลของความเข้มข้นที่ทราบและการอ่านค่าการดูดซับเส้นโค้งการสอบเทียบจะถูกสร้างขึ้น

ในการกำหนดแต่ละครั้งหรือชุดของตัวอย่างที่ผ่านการประมวลผลขอแนะนำให้ติดตั้งมาตรฐาน Bovine serum albumin 0.1-2 mg / ml สามารถใช้เป็นมาตรฐานการสอบเทียบได้

ทำการวัดด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ 540 นาโนเมตร

ค่าความเป็นเส้นตรงมีความเข้มข้นสูงสุด 12 g / dl

การรบกวน

สารที่รบกวนการทดสอบ Biuret

แม้ว่าจะไม่บ่อยนัก แต่ควรสังเกตว่าสารบางชนิดอาจรบกวนระหว่างการดำเนินการทดสอบนี้ ตัวอย่างเช่นการปรากฏตัวของแอมโมเนียสามารถยับยั้งการสร้างสีได้

ในทำนองเดียวกันสารอื่น ๆ สามารถดูดซับที่ความยาวคลื่นเดียวกันเช่นรงควัตถุบางชนิด

ในทางกลับกันสัญญาณรบกวนสามารถเกิดขึ้นได้เมื่อสารอื่นที่ไม่ใช่พันธะเปปไทด์ก่อตัวเป็นสารประกอบเชิงซ้อนกับเกลือคิวพริก ตัวอย่าง: คาร์โบไฮเดรตและไขมันบางชนิด

ในกรณีที่ตัวอย่างที่จะวิเคราะห์มีการตกตะกอนบางประเภทต้องกรองหรือหมุนเหวี่ยงก่อนที่จะติดตั้งการทดสอบ

สารที่ไม่รบกวนการทดสอบ Biuret

การทดสอบไม่ได้รับผลกระทบจากการมีอยู่ของ:

- บิลิรูบินความเข้มข้น 20 มก. / ดล.

- ฮีโมโกลบินความเข้มข้น 750 มก. / ดล.

- ขยายได้ถึงความเข้มข้น 30 ก. / ล.

- ไตรกลีเซอไรด์ความเข้มข้น 4000 มก. / ดล.

ความได้เปรียบ

- เป็นวิธีการง่ายๆในการดำเนินการ

- เป็นการทดสอบทางเศรษฐกิจ

- มีความจำเพาะสูงสำหรับโปรตีน

- รบกวนเล็กน้อย

ข้อเสีย

มีความไวต่ำในการตรวจจับโปรตีนในปริมาณต่ำ งานที่ดำเนินการโดย Fuentes et al. ยืนยันว่าวิธีการทดสอบ Biuret มีขีด จำกัด การตรวจจับโปรตีน 1 มก. / มล. และ จำกัด ปริมาณ 3 มก. / มล.

อย่างไรก็ตามงานวิจัยอื่น ๆ ที่ดำเนินการที่มหาวิทยาลัย Amazonia รายงานค่าที่ต่ำกว่ามาก ขีด จำกัด การตรวจจับที่รายงานโดยการศึกษาคือ 0.020 มก. / มล. และขีด จำกัด ปริมาณคือ 1.33 มก. / มล.

การประยุกต์ใช้งาน

น้ำยาหรือการทดสอบ Biuret ใช้สำหรับการตรวจหาโปรตีนในตัวอย่างทางคลินิกและที่ไม่ใช่ทางคลินิกในห้องปฏิบัติการประจำและห้องปฏิบัติการวิจัย

พยาธิสภาพที่เกิดขึ้นพร้อมกับการเพิ่มขึ้นหรือลดลง

ในหลายโรคสิ่งสำคัญคือต้องกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดในตัวอย่างทางคลินิกซึ่งอาจเพิ่มขึ้นหรือลดลง

พวกเขาได้รับการยกระดับใน:

- หลาย myeloma

-Systemic lupus erythematosus,

- เยื่อบุหัวใจอักเสบจากเชื้อแบคทีเรีย

- เยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อแบคทีเรีย

macroglobulinemia ของ Waldenstrom และอื่น ๆ

ลดลงใน:

- ภาวะไตวาย

- ผู้ที่มีภาวะทุพโภชนาการขั้นรุนแรง

- ผู้ป่วยที่ติดเชื้อเรื้อรังเป็นต้น

ตัวอย่างทางคลินิก

ตัวอย่างทางคลินิกที่พบบ่อยที่สุด ได้แก่ ซีรั่มพลาสมาและปัสสาวะ ค่าปกติของโปรตีนในซีรัมหรือพลาสมาคือ 6.0-8.8 gr / dl

ความเข้มข้นของโปรตีนในปัสสาวะในผู้ใหญ่ไม่เกิน 150 มก. / 24 ชั่วโมง

โปรตีนในปัสสาวะ / อัตราส่วนครีเอตินีนในปัสสาวะค่าปกติ

ทารก: <0.50 มก

เด็กอายุ 2 ปีขึ้นไปดัชนี: 0.20 มก

ผู้ใหญ่: <0.2 มก

ตัวอย่างที่ไม่ใช่ทางคลินิก

ปฏิกิริยา Biuret สามารถใช้กับตัวอย่างที่ไม่ใช่ทางคลินิกได้หลายประเภทเช่นผลิตภัณฑ์จากนมสารต่อต้านอนุมูลอิสระหรือสารที่ไม่รู้จักซึ่งคุณต้องการตรวจสอบการมีอยู่ของโปรตีน

อ้างอิง

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). การศึกษาคุณลักษณะทางเคมีกายภาพและปริมาณโปรตีนของสารสกัดของเหลวของหอยนางรมโกงกาง (Crassostrearizophorae) วารสารเคมีคิวบา, 26 (1), 66-74. สืบค้นเมื่อ 26 มิถุนายน 2019 จาก http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. ลักษณะการทำงานของเมล็ดมะม่วงอัลมอนด์ (Mangifera indica L. ) Revista Ciencia en Desarrollo 2015; 6 (1): 67-75
3. "Biuret." Wikipedia สารานุกรมเสรี 19 มิ.ย. 2019 16:37 น. UTC. 26 มิ.ย. 2019 22:18 น
4. Fuentes F, Quispe I, García J. การกำหนดมาตรฐานของวิธีการของ Biuret เพื่อหาปริมาณโปรตีนทั้งหมดใน polyvalent antibotropic serum ที่ผลิตที่ INS National Center for Biological Products โบล - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). มีจำหน่ายที่: repositorio.ins.gob.pe
5. ห้องปฏิบัติการ Winer โปรตีนทั้งหมด วิธีการกำหนดสีสำหรับการกำหนดโปรตีนทั้งหมดในซีรั่มและพลาสมา มีจำหน่ายที่: wiener-lab.com.ar