GRAM STAIN: เหตุผลวัสดุเทคนิคและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2026

ย้อมสีแกรมเป็นวิธีที่ง่ายและมีประโยชน์มากที่สุดการย้อมสีเทคนิคทางจุลชีววิทยาวินิจฉัย เทคนิคนี้สร้างขึ้นโดยแพทย์ชาวเดนมาร์ก Hans Christian Gram ในปีพ. ศ. 2427 ซึ่งสามารถจำแนกแบคทีเรียเป็นแกรมบวกและแกรมลบตามองค์ประกอบของผนังเซลล์

เทคนิคนี้ได้รับการปรับเปลี่ยนบางอย่างโดย Hucker ในปีพ. ศ. 2464 เพื่อทำให้รีเอเจนต์คงตัวและปรับปรุงคุณภาพของการย้อมสีซึ่งเป็นสาเหตุที่ทำให้ Gram stain เรียกอีกอย่างว่า Gram-Hucker

รอยเปื้อนต่างๆที่เปื้อนแกรมสเตน ก. กรัมบวก cocci. ข. แท่งลบแกรม. C. Gram-positive, polymorphonuclear และ mononuclear bacilli D. ยีสต์

ด้วยเทคนิคนี้คุณสามารถสังเกตรูปร่างของจุลินทรีย์ได้เช่นกันนั่นคือถ้าพวกมันเป็น cocci, bacilli, coccobacilli, pleomorphic, filamentous และอื่น ๆ เช่นเดียวกับการกระจายตัวในอวกาศ: ในกระจุกในห่วงโซ่แยกเป็นคู่ในเตตราด ฯลฯ

เมื่อสงสัยว่ามีการติดเชื้อแบคทีเรียตัวอย่างส่วนใหญ่ที่ได้รับควรทาบนสไลด์และย้อมแกรมเพื่อการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์

รายงาน Gram จะแนะนำแพทย์เกี่ยวกับชนิดของจุลินทรีย์ที่อาจเป็นสาเหตุของการติดเชื้อก่อนที่จะได้รับผลการเพาะเลี้ยงขั้นสุดท้าย

ในบางกรณีชีวิตของผู้ป่วยตกอยู่ในอันตรายมากดังนั้นแพทย์จึงจำเป็นต้องได้รับรายงาน Gram เพื่อทำการรักษาเชิงประจักษ์ในขณะที่พวกเขารอการระบุตัวตนของจุลินทรีย์

ตัวอย่างเช่นหาก Gram พบว่ามี Gram positive cocci ในน้ำไขสันหลังแพทย์จะแนะนำการบำบัดเบื้องต้นด้วยยาปฏิชีวนะเพื่อกำจัดแบคทีเรียชนิดนี้ตามโปรโตคอลที่กำหนดไว้สำหรับสิ่งนี้

เมื่อผลสุดท้ายมาถึงพร้อมชื่อจุลินทรีย์ที่แยกได้และยาปฏิชีวนะตามลำดับแพทย์จะประเมินว่าควรเปลี่ยนวิธีการรักษาหรือไม่ การตัดสินใจนี้จะเกิดขึ้นจากการศึกษาความอ่อนแอของจุลินทรีย์ต่อยาปฏิชีวนะที่เขาได้รับและวิวัฒนาการของผู้ป่วย

รากฐาน

นี่เป็นเทคนิคที่มีขั้นตอนพื้นฐาน 4 ขั้นตอน ได้แก่ การย้อมสีการยึดติดด้วยการย้อมสีการเปลี่ยนสีและการขัดสี ดังนั้นนอกเหนือจากการระบายสีแบคทีเรียแล้วเทคนิคนี้ยังช่วยให้พวกมันมีความแตกต่าง

คริสตัลไวโอเลตเป็นสีแรกที่ใช้ มันมีความสัมพันธ์กับ peptidoglycan และจะเปื้อนแบคทีเรียทั้งหมดที่มีสีม่วงจากนั้น lugol จะถูกวางไว้ซึ่งทำหน้าที่เป็น mordant นั่นคือมันจะทำให้เกิดการสร้างสารประกอบเชิงซ้อนของคริสตัลไวโอเลต - ไอโอดีนที่ไม่ละลายน้ำ - โปรตีนไรโบนิวเคลียร์ภายในเซลล์ .

แบคทีเรียแกรมบวกที่มีผนังหนาของเพปทิโดไกลแคนก่อตัวเป็นเชิงซ้อนมากขึ้น (คริสตัลไวโอเลต - ไอโอดีน) ดังนั้นพวกมันจึงคงสีย้อมไว้

นอกจากนี้ยังส่งผลให้ผนังของแบคทีเรียแกรมบวกมีกรดไม่อิ่มตัวจำนวนมากขึ้นซึ่งแสดงถึงความสัมพันธ์ที่ดีสำหรับตัวออกซิไดซ์ (Lugol)

ในขณะเดียวกันแบคทีเรียแกรมลบมีชั้นบาง ๆ ของเปปทิโดไกลแคนซึ่งทำให้แบคทีเรียสร้างเชิงซ้อนน้อยกว่าแบคทีเรียแกรมบวก

จากนั้นก็มาถึงขั้นตอนการเปลี่ยนสีซึ่งแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบทำงานแตกต่างกัน

แบคทีเรียแกรมลบมีเยื่อหุ้มชั้นนอกที่อุดมไปด้วย lipopolysaccharides ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของผนังเซลล์ ไขมันถูกทำลายโดยการสัมผัสกับแอลกอฮอล์อะซิโตนดังนั้นเมมเบรนด้านนอกจึงไม่เสถียรและปล่อยผลึกสีม่วงออกมา

นี่คือวิธีที่ตอบโต้ด้วย safranin หรือ fuchsin พื้นฐานเปลี่ยนเป็นสีแดง

ในกรณีของแบคทีเรียแกรมบวกจะต้านทานการซีดจางเนื่องจากสารฟอกขาวทำงานโดยการปิดรูขุมขนป้องกันไม่ให้คอมเพล็กซ์คริสตัลไวโอเลต / ไอโอดีนรั่วไหลออกมา

ดังนั้นการให้สีด้วยคริสตัลไวโอเลตจึงคงที่และไม่มีที่ว่างสำหรับซาฟรานินหรือฟูซิน นี่คือสาเหตุที่แบคทีเรียเหล่านี้เปื้อนสีน้ำเงินเข้มหรือสีม่วง

วัสดุ

ชุดย้อมสีของ Gram ประกอบด้วย:

• แก้วสีม่วง
• ลูโกล
• แอลกอฮอล์อะซิโตน
• Safranin หรือ Fuchsin พื้นฐาน

การเตรียมสีย้อมและน้ำยา

สารละลายคริสตัลไวโอเลต

แนวทางแก้ไข:

คริสตัลสีม่วง ------------- 2 กรัม

เอทิลแอลกอฮอล์ 95% ----------- 20cc

โซลูชัน B:

แอมโมเนียมออกซาเลต ----------- 0.8 gr

น้ำกลั่น ------------- 80 cc

สำหรับการเตรียมคริสตัลไวโอเลตขั้นสุดท้ายสารละลาย A ต้องเจือจาง 1:10 ด้วยน้ำกลั่นและผสมกับสารละลาย B 4 ส่วนส่วนผสมจะถูกเก็บไว้ 24 ชั่วโมงก่อนใช้ กรองลงในขวดย้อมสีอำพันโดยใช้กระดาษกรอง

จำนวนเงินที่ต้องใช้ในแต่ละวันจะถูกโอนไปยังขวดหยดสีเหลืองอำพัน

ไอโอโด - ลูโกล

ชั่งน้ำหนักและวัดปริมาณที่ระบุของแต่ละสารประกอบดังต่อไปนี้:

ผลึกไอโอดีน ------------- 1gr

โพแทสเซียมไอโอไดด์ ------------- 2gr

น้ำกลั่น ------------- 300 ซีซี

โพแทสเซียมไอโอไดด์ละลายในน้ำทีละน้อยจากนั้นจึงเติมไอโอดีน วิธีแก้ปัญหาคือโกนลงในขวดสีเหลืองอำพัน

ปริมาณที่ต้องใช้ทุกวันจะถูกโอนไปยังขวดสีเหลืองอำพันขนาดเล็กที่มีหลอดหยด

ฟอกสี

เอทิลแอลกอฮอล์ 95% -----------– 50 มล

อะซิโตน ------------------ 50 มล

เตรียมในส่วนที่เท่ากัน ปิดฝาให้ดีเนื่องจากมีแนวโน้มที่จะระเหย

วางในขวดหยด

การเตรียมนี้จะทำให้เกิดการเปลี่ยนสีในเวลาปานกลาง 5-10 วินาทีและแนะนำมากที่สุด

ผู้เริ่มต้นชอบใช้เอทิลแอลกอฮอล์ 95% เท่านั้นซึ่งการซีดจางจะช้ากว่า 10 ถึง 30 วินาที

ในขณะที่ผู้มีประสบการณ์มากขึ้นสามารถใช้อะซิโตนบริสุทธิ์ได้ซึ่งการเปลี่ยนสีจะเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วตั้งแต่ 1 ถึง 5 วินาที

ความคมชัด

Safranin Stock Solution

Safranina -------------– 2.5 กรัม

เอทิลแอลกอฮอล์ 95% --------– 100 ซีซี

หลังจากชั่งน้ำหนัก safranin ตามจำนวนที่ระบุแล้วจะละลายในเอทิลแอลกอฮอล์ 95% 100 มล.

โซลูชัน Safranin ที่ใช้งานได้นั้นเตรียมจากสารละลายสต็อค

ในการทำเช่นนี้ให้ตวงสารละลายสต็อก 10 ซีซีเติมน้ำกลั่น 90 ซีซีเพื่อให้ได้ 100 มล.

ขอแนะนำให้โอนปริมาณที่จะใช้ทุกวันไปยังขวดสีเหลืองอำพันพร้อมหลอดหยด

จุลินทรีย์ที่ย้อมสีแกรมลบอย่างอ่อน ๆ ด้วยคราบแกรม - ฮัคเกอร์เช่นแอนแอโรบิค Legionella sp Campylobacter sp และ Brucella sp สามารถย้อมสีได้ดีขึ้นมากโดยใช้การดัดแปลงของ Kopeloff ในการย้อมแกรม - ฮัคเกอร์ เรียกว่า Gram-Kopeloff stain

เทคนิคนี้เปลี่ยนสีย้อมซาฟรานินเป็นฟูซินพื้นฐาน ด้วยการดัดแปลงนี้ทำให้สามารถย้อมสีจุลินทรีย์ดังกล่าวได้อย่างมีประสิทธิภาพ

การจัดเก็บน้ำยา

ควรเก็บสีที่เตรียมไว้ในอุณหภูมิห้อง

การเตรียมสเมียร์ของตัวอย่างที่จะทำสี

ตัวอย่างต้องมีจุลินทรีย์อย่างน้อย 10 ^{5 ตัว}ก่อนที่จะสังเกตเห็นจุลินทรีย์ในสเมียร์ รอยเปื้อนสามารถทำจากตัวอย่างโดยตรงหรือจากวัฒนธรรมในสื่อของแข็งหรือของเหลว

รอยเปื้อนควรมีความสม่ำเสมอกระจายตัวได้ดีและไม่หนาเกินไปเพื่อให้เห็นภาพของโครงสร้างที่ดีขึ้น

-Gram ของตัวอย่างโดยตรง

กรัมของปัสสาวะที่ไม่ผ่านการหมุนเหวี่ยง

ปัสสาวะผสมและ 10 µl วางบนสไลด์ การสังเกตแบคทีเรียอย่างน้อยหนึ่งช่อง / Dip แสดงว่ามีการติดเชื้อ

ซึ่งหมายความว่าวัฒนธรรมจะมีปัสสาวะประมาณมากกว่า 100,000 CFU / ml (10 ⁵ CFU / mL) ใน 85% ของกรณี

วิธีนี้ไม่มีประโยชน์สำหรับจำนวนอาณานิคมที่ต่ำกว่า 100,000 CFU

CSF Gram

CSF ควรหมุนเหวี่ยงเอาส่วนเหนือตะกอนออกและเม็ดกระจายบนสไลด์ ของเหลวนี้ปราศจากเชื้อภายใต้สภาวะปกติ การสังเกตแบคทีเรียบ่งชี้ว่ามีการติดเชื้อ

กรัมของตัวอย่างระบบทางเดินหายใจ

การล้างเสมหะหลอดลมหรือหลอดลมหลอดเลือดแม้ว่าอาจมีจุลินทรีย์หลายชนิด แต่จะเป็นแนวทางในการวินิจฉัยเสมอนอกจากจะมีประโยชน์ตามชนิดของเซลล์ที่สังเกตได้แล้ว

ในกรณีของเสมหะควรเตรียมสเมียร์ด้วยส่วนที่เป็นหนองมากที่สุดของตัวอย่าง

กรัมของอุจจาระ

ไม่แนะนำให้ใช้ Gram กับตัวอย่างประเภทนี้เนื่องจากไม่มีค่าการวินิจฉัย

- พืชผล

พวกเขาสามารถทำได้สองวิธีหนึ่งจากวัฒนธรรมเหลวและอีกวิธีหนึ่งจากวัฒนธรรมที่เป็นของแข็ง

วัฒนธรรมเหลว

จากวัฒนธรรมของเหลวมันง่ายมาก น้ำซุปขุ่นหลายชิ้นจะถูกนำไปอบใต้เตาและวางบนสไลด์ที่สะอาดและแห้งโดยเคลื่อนไหวเป็นวงกลมจากตรงกลางไปยังรอบนอกเพื่อกระจายวัสดุอย่างเท่าเทียมกัน

ปล่อยให้แห้งตามธรรมชาติในอากาศ เมื่อแห้งแล้ววัสดุจะถูกยึดเข้ากับแผ่นด้วยความร้อน ในการทำเช่นนี้ด้วยความช่วยเหลือของแหนบแผ่นจะถูกส่งผ่านเปลวไฟของเตา Bunsen 3 ถึง 4 ครั้งระวังอย่าให้วัสดุไหม้

แผ่นงานได้รับอนุญาตให้เย็นและวางบนสะพานระบายสี

พืชที่เป็นของแข็ง

หากต้องการทำการละเลงคราบแกรมจากวัฒนธรรมที่มั่นคงให้ดำเนินการดังนี้:

ก่อนที่จะเลือกโคโลนีที่จะถ่ายต้องเตรียมสไลด์โดยใส่น้ำเกลือที่ปราศจากเชื้อประมาณสองหยด

หากจานเพาะเชื้อดั้งเดิมมีโคโลนีหลายประเภทจะมีการเลือกโคโลนีที่แยกจากกันเพื่อทำแกรม แต่ละโคโลนีจะถูกนำไปด้วยห่วงทองคำขาวเพื่อละลายในน้ำเกลือที่วางไว้ก่อนหน้านี้บนสไลด์

การเคลื่อนไหวแบบวงกลมทำจากศูนย์กลางไปยังรอบนอกเพื่อกระจายอาณานิคมบนสไลด์อย่างเป็นเนื้อเดียวกัน

ปล่อยให้แห้งตามธรรมชาติในอากาศ เมื่อแห้งแล้วแผ่นจะถูกยึดด้วยความร้อนตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (โดยการเผาสไลด์ด้วยไฟแช็ก) ระวังอย่าให้วัสดุไหม้

ขั้นตอนนี้ต้องทำกับโคโลนีแต่ละประเภท บนแผ่นกระดาษควรสังเกตลำดับของสิ่งที่สังเกตเช่น:

อาณานิคม 1: โคโลนีสีเหลืองเบต้า - เฮโมไลติก: พบ cocci Gram positive ในกลุ่ม

อาณานิคมที่ 2: อาณานิคมสีครีมไม่มีการแตกของเม็ดเลือดแดง: พบ coccobacilli Gram negative

แต่ละสไลด์ต้องติดป้ายกำกับเพื่อให้ทราบว่าเรากำลังสังเกตอะไร

เทคนิค

เทคนิคการย้อมสีแกรมทำได้ง่ายมากและมีราคาไม่แพงนักและไม่ควรพลาดในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา

ทำได้ดังนี้:

1. แก้ไขรอยเปื้อนด้วยความร้อนและวางบนสะพานย้อมสี
2. ปิดสไลด์ให้สนิทด้วยคริสตัลไวโอเลตเป็นเวลา 1 นาที
3. ล้างออกด้วยน้ำ อย่าให้แห้ง
4. คลุมแผ่นด้วยสารละลายลูโกลทิ้งไว้ 1 นาที ล้างออกด้วยน้ำ อย่าให้แห้ง
5. Bleach ประมาณ 5-10 วินาทีโดยเขย่าเบา ๆ ในแอลกอฮอล์อะซิโตน หรือวางแผ่นในแนวตั้งแล้วหยดน้ำยาลดสีลงบนพื้นผิวจนกว่ากระจกสีม่วงส่วนเกินจะหลุดออก ไม่เกิน.
6. ล้างออกด้วยน้ำ อย่าให้แห้ง
7. เปลี่ยนสไลด์บนสะพานย้อมสีและปิดทับเป็นเวลา 30 วินาทีด้วย safranin (Gram-Hucker) หรือ 1 นาทีด้วย fuchsin พื้นฐาน (Gram-Kopeloff)
8. ล้างด้วยน้ำ
9. ปล่อยให้อากาศแห้งตามธรรมชาติในตำแหน่งตั้งตรง

เมื่อแห้งแล้วให้วางน้ำมันแช่ 1 หยดเพื่อสังเกตภายใต้วัตถุประสงค์ 100X ในกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

ยูทิลิตี้

เทคนิคนี้ช่วยในการแยกแยะความแตกต่างทางสัณฐานวิทยาของแบคทีเรียส่วนใหญ่

ยีสต์ยังโดดเด่นด้วยสีนี้ พวกเขาใช้คริสตัลไวโอเลตนั่นคือพวกมันเปื้อนแกรมบวก

ในทางกลับกันแท่งแกรมบวกที่สร้างสปอร์สามารถแยกแยะได้ซึ่งสังเกตเห็นช่องว่างที่ชัดเจนภายในบาซิลลัสซึ่งเอนโดสปอร์ก่อตัวขึ้นแม้ว่าสปอร์จะไม่เปื้อน เทคนิคอื่น ๆ เช่น Shaeffer-Fulton ใช้ในการย้อมสีสปอร์

ควรสังเกตว่าการย้อมสีนี้ไม่ได้ใช้ในการย้อมสีของแบคทีเรียทุกประเภทนั่นคือมีบางกรณีที่การย้อมสีไม่ได้ผล

ในกรณีนี้สามารถกล่าวถึงแบคทีเรียที่ไม่มีผนังเซลล์ได้ ตัวอย่างเช่นสกุล Mycoplasma, spheroplasts, ureaplasma, L-form และ protoplasts

นอกจากนี้ยังเปื้อนแบคทีเรียที่ไม่ดีอย่างมากด้วยผนังที่อุดมไปด้วยกรดไมโคลิกเช่น Mycobacteria และแบคทีเรียภายในเซลล์เช่น Chlamydias และ Rickettsias

นอกจากนี้ยังใช้ไม่ได้ผลในการย้อมสีแบคทีเรียส่วนใหญ่

มีแบคทีเรียในสกุลเดียวกันที่สามารถสังเกตได้ในตัวอย่างเดียวกับ Gram positive และ Gram negative เมื่อสิ่งนี้เกิดขึ้นจะเรียกว่าคราบแกรมตัวแปรซึ่งอาจเกิดจากการเปลี่ยนแปลงของสารอาหารอุณหภูมิ pH หรือความเข้มข้นของอิเล็กโทรไลต์

ข้อผิดพลาดทั่วไป

การฟอกสีที่เกินจริง

การพูดเกินจริงในขั้นตอนการเปลี่ยนสีอาจนำไปสู่การสังเกตจุลินทรีย์แกรมลบที่ผิดพลาด

ไม่ต้องรอนานพอที่จะเติมน้ำมันแช่

อาจทำให้แบคทีเรียแกรมบวกเปื้อนแกรมลบ (แกรมลบเท็จ) สิ่งนี้เกิดขึ้นเนื่องจากในวัฒนธรรมเก่ามีแนวโน้มที่จะมีแบคทีเรียที่ตายหรือเน่าเสียและภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้แบคทีเรียจะไม่กักเก็บคริสตัลไวโอเลตไว้

ใช้น้ำยา lugol เก่ามาก:

เมื่อเวลาผ่านไป lugol จะสูญเสียคุณสมบัติและสีของมันจะจางลง หากใช้รีเอเจนต์ที่เสื่อมสภาพไปแล้วจะไม่สามารถแก้ไขคริสตัลไวโอเลตได้ดีดังนั้นจึงมีความเป็นไปได้ที่จะได้รับการแสดงภาพของจุลินทรีย์แกรมลบที่ผิดพลาด

พื้นหลังสีน้ำเงิน

พื้นหลังที่เปลี่ยนสีอย่างถูกต้องจะเป็นสีแดง พื้นหลังสีน้ำเงินแสดงว่าการเปลี่ยนสีไม่เพียงพอ

อ้างอิง

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. เชอร์ริส จุลชีววิทยาทางการแพทย์รุ่นที่ 6 McGraw-Hill นิวยอร์กสหรัฐอเมริกา
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา (ฉบับที่ 5) อาร์เจนตินาบรรณาธิการ Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 เอ็ด อาร์เจนตินา. กองบรรณาธิการ Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. ตำนานวิทยาทั่วไป. 2nd Ed. Central University of Venezuela, Library Editions. เวเนซุเอลาการากัส
5. "คราบแกรม" Wikipedia สารานุกรมเสรี 4 ต.ค. 2561, 23:40 น. UTC. 9 ธ.ค. 2561, 17:11 น. นำมาจาก es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. คู่มือจุลชีววิทยาทางการแพทย์. พิมพ์ครั้งที่ 2 เวเนซุเอลา: ผู้อำนวยการฝ่ายสื่อและสิ่งพิมพ์ของมหาวิทยาลัยคาราโบโบ
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. คราบพื้นฐานในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา การวิจัยในความพิการ. 2557; 3 (1): 10-18.