GIEMSA STAIN: เหตุผลวัสดุเทคนิคและการใช้งาน - ชีววิทยา

Giemsa คราบเป็นชนิดของสีตัวอย่างทางคลินิกขึ้นอยู่กับส่วนผสมของสีย้อมกรดและพื้นฐาน การสร้างสรรค์นี้ได้รับแรงบันดาลใจจากผลงานของ Romanowsky ซึ่ง Gustav Giemsa นักเคมีและนักแบคทีเรียจากประเทศเยอรมนีได้ปรับปรุงให้สมบูรณ์แบบโดยการเติมกลีเซอรอลเพื่อทำให้สารประกอบคงตัว

การเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นกับเทคนิค Romanowsky ดั้งเดิมทำให้สามารถปรับปรุงการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้มากดังนั้นเทคนิคนี้จึงได้รับการบัพติศมาด้วยชื่อของ Giemsa stain

ตัวอย่างต่างๆที่เปื้อนด้วยคราบ Giemsa A. Trypanosoma evansi ในเลือดส่วนปลาย ข. เม็ดเลือดปกติ. C. Borrelia theileri ในเลือดส่วนปลาย D. มะเร็งต่อมน้ำเหลืองของ Burkitt

เนื่องจากเป็นเทคนิคที่เรียบง่ายใช้งานได้ดีและประหยัดปัจจุบันจึงมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการทางคลินิกสำหรับรอยเปื้อนทางโลหิตวิทยาตัวอย่างไขกระดูกและส่วนของเนื้อเยื่อ

เทคนิคการย้อมสีของ Giemsa มีประโยชน์มากสำหรับการศึกษาทางเซลล์วิทยาเนื่องจากสามารถสังเกตโครงสร้างของเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงได้ เทคนิคนี้จะย้อมไซโตพลาสม์นิวเคลียสนิวคลีโอลิแวคิวโอลและแกรนูลของเซลล์สามารถแยกแยะได้แม้กระทั่งร่องรอยของโครมาติน

นอกจากนี้ยังสามารถตรวจพบการเปลี่ยนแปลงขนาดรูปร่างหรือสีของนิวเคลียสอย่างมีนัยสำคัญซึ่งเป็นไปได้ที่จะเห็นภาพการสูญเสียความสัมพันธ์ของนิวเคลียสกับไซโทพลาสซึม

ในทางกลับกันจะช่วยให้สามารถระบุเซลล์ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะในไขกระดูกและเลือดส่วนปลายซึ่งมีความสำคัญต่อการวินิจฉัยโรคร้ายแรงเช่นมะเร็งเม็ดเลือดขาว นอกจากนี้ยังสามารถตรวจพบ hemoparasites, แบคทีเรียภายนอกเซลล์, เชื้อราและอื่น ๆ

ในเซลล์พันธุศาสตร์มีการใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากสามารถศึกษาการไมโทซิสของเซลล์ได้

พื้นฐานของการย้อมสี Giemsa

สีย้อมประเภท Romanowsky ขึ้นอยู่กับการใช้ความแตกต่างระหว่างสีย้อมที่เป็นกรดและสีพื้นฐานเพื่อให้ได้โครงสร้างพื้นฐานและกรดตามลำดับ ดังจะเห็นได้ว่ามีความสัมพันธ์ของสีย้อมกรดในการย้อมโครงสร้างพื้นฐานและในทางกลับกัน

สีย้อมพื้นฐานที่ใช้คือเมทิลีนบลูและอนุพันธ์ออกซิไดซ์ (Azure A และ Azure B) ในขณะที่สีย้อมกรดคืออีโอซิน

โครงสร้างกรดของเซลล์คือกรดนิวคลีอิกซึ่งเป็นแกรนูลของเบโซฟิลที่แบ่งส่วนและอื่น ๆ ดังนั้นพวกมันจะถูกย้อมด้วยเมทิลีนบลู

ในแง่เดียวกันนี้โครงสร้างพื้นฐานของเซลล์คือฮีโมโกลบินและแกรนูลบางส่วนเช่นที่มีอยู่ในอีโอซิโนฟิลแบบแบ่งส่วนเป็นต้น สิ่งเหล่านี้จะถูกย้อมด้วย eosin

ในทางกลับกันเนื่องจากเมทิลีนบลูและสีฟ้ามีลักษณะเฉพาะด้วยการเป็นสีเมทาโครมาติกจึงสามารถให้เฉดสีที่แตกต่างกันไปตามโครงสร้างที่แตกต่างกันตามภาระของโพลีเอเนียนที่มีอยู่

นี่คือวิธีการผสมผสานเชิงกลยุทธ์ของสีย้อมพื้นฐานและสีกรดในการพัฒนาสีที่หลากหลายตามลักษณะทางชีวเคมีของแต่ละโครงสร้างโดยเดินผ่านสีน้ำเงินซีดน้ำเงินเข้มม่วงและม่วงในกรณีของโครงสร้างกรด

ในขณะที่การให้สีของ eosin มีความเสถียรมากกว่าโดยให้สีระหว่างส้มแดงและปลาแซลมอน

วัสดุ

วัสดุสำหรับเตรียมสารละลายสต็อก

การเตรียมสารละลายสต็อกต้องชั่ง Giemsa Stain แบบผง 600 มก. ตวงเมทิลแอลกอฮอล์ 500 มล. ปราศจากอะซิโตนและกลีเซอรีนเป็นกลาง 50 มล.

วิธีเตรียมสต๊อกสินค้า

วางผง Giemsa ที่มีน้ำหนักมากในครก หากมีก้อนควรฉีดพ่น จากนั้นเติมกลีเซอรีนในปริมาณที่เห็นได้และผสมให้เข้ากัน ส่วนผสมที่ได้จะถูกเทลงในขวดสีเหลืองอำพันที่สะอาดมาก

ส่วนที่เหลือของกลีเซอรีนวางไว้ในปูน ผสมอีกครั้งเพื่อทำความสะอาดส่วนที่เหลือของสีที่ติดผนังปูนแล้วเทลงในโถเดียวกัน

ขวดถูกปิดฝาและวางไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ55ºCเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ในขณะที่อยู่ในอ่างน้ำค่อยๆเขย่าส่วนผสมทุกๆครึ่งชั่วโมง

ต่อจากนั้นส่วนผสมจะได้รับอนุญาตให้เย็นเพื่อวางแอลกอฮอล์ ก่อนหน้านี้ส่วนหนึ่งของแอลกอฮอล์ที่วัดได้จะถูกวางลงในปูนเพื่อล้างสีที่เหลือให้เสร็จจากนั้นจึงเติมลงในส่วนผสมพร้อมกับแอลกอฮอล์ที่เหลือ

การเตรียมนี้ควรปล่อยให้สุกเป็นเวลาอย่างน้อย 2 สัปดาห์ ควรกรองส่วนที่ใช้แล้วของสารละลายสต็อก

เพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของสารเตรียมขอแนะนำให้ถ่ายโอนส่วนที่จะต้องใช้อย่างต่อเนื่องไปยังขวดสีเหลืองอำพันขนาดเล็กที่มีหลอดหยด เติมทุกครั้งที่น้ำยาหมด

วัสดุในการเตรียมสารละลายบัฟเฟอร์

ในทางกลับกันสารละลายบัฟเฟอร์ที่ pH 7.2 ถูกเตรียมไว้ดังนี้:

โซเดียมฟอสเฟต 6.77 กรัม (ปราศจากน้ำ) (NaHPO ₄ ) โพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต 2.59 กรัม (KH ₂ PO ₄ ) และน้ำกลั่นจะมีน้ำหนักไม่เกิน 1,000 ซีซี

การเตรียมสีขั้นสุดท้าย

สำหรับการเตรียมสารละลายย้อมสีขั้นสุดท้ายจะวัดสารละลายสต็อกที่กรองแล้ว 2 มล. และผสมกับสารละลายบัฟเฟอร์ 6 มล. ผัดส่วนผสม

ข้อเท็จจริงที่เกี่ยวข้องที่ต้องนำมาพิจารณาคือเทคนิคการเตรียมสีสามารถเปลี่ยนแปลงได้ขึ้นอยู่กับ บริษัท การค้า

วัสดุเพิ่มเติมที่จำเป็นในการทำสี

นอกเหนือจากวัสดุที่อธิบายไว้คุณต้องมีสะพานระบายสีเสื้อยืดที่มีน้ำหรือบัฟเฟอร์สำหรับซักผ้าสไลด์วัตถุหรือผ้าคลุมวัตถุนาฬิกาจับเวลาเพื่อควบคุมเวลาในการระบายสีและกระดาษซับมันหรือวัสดุบางอย่างที่สามารถใช้ในการทำให้แห้งได้ ( ผ้ากอซหรือผ้าฝ้าย)

เทคนิค

กระบวนการย้อมสี

1) ก่อนการย้อมสีต้องเตรียมการละเลงตัวอย่างบนสไลด์ที่สะอาด

ตัวอย่างอาจเป็นเลือดไขกระดูกส่วนเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อหรือตัวอย่างปากมดลูก - ช่องคลอด ขอแนะนำให้สเปรดบาง ๆ และแห้ง 1 หรือ 2 ชั่วโมงก่อนลงสี

2) บนสะพานระบายสีให้วางแผ่นงานทั้งหมดที่ต้องทำสี คุณทำงานในลำดับเดียวกันเสมอและแต่ละแผ่นจะถูกระบุไว้อย่างดี

3) หยดเมทิลแอลกอฮอล์ 100% (เมทานอล) สองสามหยดลงบนสเมียร์และปล่อยให้ทำหน้าที่เป็นเวลา 3 ถึง 5 นาทีเพื่อแก้ไขและทำให้ตัวอย่างแห้ง

4) ทิ้งเมทานอลที่มีอยู่บนแผ่นและปล่อยให้แห้ง

5) เมื่อแห้งแล้วให้วางน้ำยาย้อมสีสุดท้ายด้วยหลอดหยดจนทั่วทั้งแผ่น ทิ้งไว้ 15 นาที ผู้เขียนบางคนแนะนำให้มากถึง 25 นาที มันขึ้นอยู่กับบ้านธุรกิจ

6) ระบายคราบและล้างสเมียร์ด้วยน้ำกลั่นหรือด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ 7.2

7) บนกระดาษซับมันปล่อยให้แผ่นแห้งในที่โล่งจัดเรียงในแนวตั้งโดยใช้ไม้พยุง

8) ทำความสะอาดด้านหลังของสไลด์ด้วยก้านแอลกอฮอล์หรือสำลีก้านเพื่อขจัดคราบสกปรก

ยูทิลิตี้

เทคนิคการย้อมสีของ Giemsa ถูกนำมาใช้ในด้านต่างๆ ได้แก่ โลหิตวิทยา, วิทยาวิทยา, แบคทีเรียวิทยา, ปรสิตวิทยา, เซลล์วิทยาและเซลล์พันธุศาสตร์

โลหิตวิทยา

เป็นการใช้บ่อยที่สุดสำหรับคราบนี้ ด้วยเซลล์เหล่านี้สามารถระบุเซลล์แต่ละเซลล์ที่มีอยู่ในไขกระดูกหรือตัวอย่างเลือดที่อยู่รอบข้างได้ เช่นเดียวกับการประมาณจำนวนของแต่ละซีรีส์ความสามารถในการตรวจพบเม็ดเลือดขาวหรือเม็ดเลือดขาวภาวะเกล็ดเลือดต่ำ ฯลฯ

เนื่องจากมีความไวในการระบุเซลล์ที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะจึงมีความเกี่ยวข้องในการวินิจฉัยโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวเฉียบพลันหรือเรื้อรัง นอกจากนี้ยังสามารถวินิจฉัยโรคโลหิตจางได้เช่นโรคโลหิตจางชนิดเคียวเซลล์รูปเคียวเป็นต้น

Mycology

ในพื้นที่นี้มักใช้ในการค้นหา Histoplasma capsulatum (เชื้อราในเซลล์) ในตัวอย่างเนื้อเยื่อ

แบคทีเรียวิทยา

ในรอยเปื้อนทางโลหิตวิทยาที่ย้อมด้วย Giemsa สามารถตรวจพบ Borrelias sp ในผู้ป่วยที่เป็นโรคที่เรียกว่าไข้กำเริบ Spirochetes มีมากในหมู่เม็ดเลือดแดงในตัวอย่างที่ถ่ายในช่วงที่มีไข้สูงสุด

นอกจากนี้ยังสามารถมองเห็นภาพแบคทีเรียภายในเซลล์เช่น Rickettsia sp และ Chlamydia trachomatis ในเซลล์ที่ติดเชื้อ

ปรสิตวิทยา

ในสาขาปรสิตวิทยาการย้อมสี Giemsa ทำให้สามารถวินิจฉัยโรคปรสิตเช่นมาลาเรียโรค Chagas และโรค leishmaniasis

ในสองครั้งแรกสามารถเห็นพยาธิ Plasmodium sp และ Trypanosoma cruzi ตามลำดับได้ในเลือดส่วนปลายของผู้ป่วยที่ติดเชื้อสามารถพบได้ในระยะต่างๆกันขึ้นอยู่กับระยะของโรค

เพื่อปรับปรุงการค้นหาปรสิตในเลือดขอแนะนำให้ใช้คราบ Giemsa ผสมกับคราบ May-Grünwald

ในทำนองเดียวกัน leishmaniasis ทางผิวหนังสามารถวินิจฉัยได้โดยการประเมินตัวอย่างการตรวจชิ้นเนื้อผิวหนังที่ย้อมสี Giemsa ที่พบพยาธิ

เซลล์วิทยา

การย้อมสี Giemsa ยังใช้สำหรับการศึกษาทางเซลล์วิทยาของตัวอย่าง endocervical แม้ว่าจะไม่ใช่เทคนิคที่ใช้บ่อยที่สุดสำหรับจุดประสงค์นี้

แต่ในกรณีที่ทรัพยากรขาดแคลนสามารถใช้งานได้โดยมีฟังก์ชันการทำงานคล้ายกับที่นำเสนอโดยเทคนิค Papanicolaou และมีต้นทุนที่ต่ำกว่า อย่างไรก็ตามต้องอาศัยความชำนาญในส่วนของผู้ตรวจสอบ

เซลล์พันธุศาสตร์

คุณสมบัติที่เกี่ยวข้องของการย้อมสี Giemsa คือความสามารถในการจับกับบริเวณที่อุดมไปด้วยอะดีนีนและไธมีนของดีเอ็นเอ สิ่งนี้ช่วยให้สามารถมองเห็นดีเอ็นเอในระหว่างการไมโทซิสของเซลล์ในสถานะการควบแน่นที่แตกต่างกัน

การศึกษาเหล่านี้จำเป็นในการตรวจหาความผิดเพี้ยนของสีเช่นการทำซ้ำการลบหรือการเปลี่ยนตำแหน่งของบริเวณต่างๆของโครโมโซม

การวิจัยแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพของ Giemsa stain

Cannova et al (2016) เปรียบเทียบเทคนิคการย้อมสี 3 แบบสำหรับการวินิจฉัยโรค leishmaniasis ที่ผิวหนัง

สำหรับสิ่งนี้พวกเขาใช้ตัวอย่างที่ได้จากสัตว์ทดลอง (Mesocrisetus auratus) ทดลองฉีดเชื้อ Leishmanias

ผู้เขียนแสดงให้เห็นว่าคราบ Giemsa ดีกว่า Pap-mart®และ Gaffney stain ดังนั้นพวกเขาจึงคิดว่าคราบ Giemsa นั้นเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการวินิจฉัยโรค leishmaniasis ที่ผิวหนัง

ผลลัพธ์ที่ยอดเยี่ยมที่ผู้เขียนได้รับเกิดจากความจริงที่ว่าการผสมของสีย้อมที่ประกอบเป็นส่วนผสมของ Giemsa นำเสนอเงื่อนไขที่จำเป็นในการสร้างความเปรียบต่างที่ดีทำให้โครงสร้างของ amastigotes สามารถแยกแยะได้อย่างชัดเจนทั้งในเซลล์และนอกเซลล์

เทคนิคอื่น ๆ (Pap-mart®และ Gaffney) ก็ทำเช่นกัน แต่ด้วยวิธีที่อ่อนแอกว่าและทำให้เห็นภาพได้ยากขึ้น นั่นคือเหตุผลที่แนะนำให้ใช้คราบ Giemsa สำหรับการวินิจฉัยทางพยาธิวิทยาของ leishmaniasis

ในทำนองเดียวกันการศึกษาของRamírez et al (1994) ได้ประเมินความถูกต้องของคราบ Giemsa และ Lendrum ในรอยเปื้อน conjunctival สำหรับการระบุ Chlamydia trachomatis

ผู้เขียนระบุว่าคราบ Giemsa และ Ledrum มีความจำเพาะเท่ากัน แต่พบว่า Giemsa มีความอ่อนไหวมากกว่า

สิ่งนี้อธิบายได้ว่าทำไม Giemsa stain จึงถูกใช้บ่อยที่สุดในการวินิจฉัยการติดเชื้อหนองในเทียมโดยเฉพาะอย่างยิ่งหากมีทรัพยากรน้อย

ที่มา: PanReac Applichem ITW Reagents Giemsa คราบ เวอร์ชัน 2: JMBJUL17 CEIVD10ES Castellar del Vallés, สเปน

คำแนะนำสำหรับการย้อมสีที่ดี

ไม่ควรเร่งการอบแห้งของผ้าปูที่นอน ต้องใช้เวลาพอสมควรในการทำให้แห้งในที่โล่ง ประมาณ 2 ชั่วโมง

สีทันทีหลังจากผ่านไป 2 ชั่วโมงเพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด

เพื่อให้รอยเปื้อนแก้ไขและเปื้อนได้ดีขึ้นจะต้องกระจายตัวอย่างบนสไลด์ในลักษณะที่ยังคงมีชั้นที่บางและสม่ำเสมอ

ตัวอย่างเลือดที่ต้องการคือเส้นเลือดฝอยเนื่องจากสเมียร์ทำโดยตรงจากหยดเลือดดังนั้นตัวอย่างจึงไม่มีสารเติมแต่งใด ๆ ซึ่งช่วยในการบำรุงรักษาโครงสร้างของเซลล์

อย่างไรก็ตามหากมีการใช้เลือดดำ EDTA ควรใช้เป็นยาต้านการแข็งตัวของเลือดไม่ใช่เฮปารินเนื่องจากเฮปารินมักจะทำให้เซลล์เสียรูป

ข้อผิดพลาดทั่วไปในการย้อมสี Giemsa

ในการฝึกทำสีผิดพลาดนี้สามารถทำได้ พวกเขาเห็นได้จากการเปลี่ยนแปลงโทนเสียงของโครงสร้างอย่างกะทันหัน

สีฟ้ามาก

อาจเกิดจาก:

รอยเปื้อนหนามาก
เกินเวลาในการย้อมสี
ล้างไม่เพียงพอ
การใช้รีเอเจนต์ที่มีค่า pH เป็นกลาง (ด่าง) สูงกว่า

ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้สีของโครงสร้างต่อไปนี้จะผิดเพี้ยนไปในลักษณะที่เม็ดเลือดแดงแทนที่จะย้อมสีชมพูแซลมอนจะปรากฏเป็นสีเขียวเม็ดของอีโอซิโนฟิลที่ต้องย้อมด้วยอิฐสีแดงจะเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงินหรือสีเทาและต่อไปจะมี การเบี่ยงเบนในโทนปกติ

สีชมพูมากเกินไป