LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: รองพื้นการเตรียมและการใช้งาน - ชีววิทยา

Löwensteinเซ่นกลางเป็นสื่อที่เป็นของแข็งเลือกสำหรับการแยกและการพัฒนาของเชื้อแบคทีเรียของเชื้อชนิดเช่นเชื้อวัณโรค, M. avium หมู่คนอื่น ๆ ด้วยข้อยกเว้นของสายพันธุ์ leprae ซึ่งไม่ culturable

แบคทีเรียในสกุล Mycobacterium ไม่เติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเดิมดังนั้นจึงจำเป็นต้องออกแบบสื่อพิเศษสำหรับการแยกเชื้อ สื่อดั้งเดิมสร้างขึ้นโดยLöwensteinและต่อมาได้รับการแก้ไขโดย Jensen

Löwenstein-Jensen เป็นสื่อที่มีอาณานิคมของ Mycobacterium tuberculosis ที่มา: Agarwal et al / BioMed Central Ltd. ได้รับความอนุเคราะห์จาก Biology Image Library

การดัดแปลงประกอบด้วยการกำจัดสีแดงของคองโกแทนที่ด้วยสีเขียวมาลาไคต์ที่มีความเข้มข้นสูงขึ้น นอกจากนี้ยังเปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของแมกนีเซียมซิเตรตและโมโนโปแตสเซียมฟอสเฟต

ปัจจุบันLöwenstein-Jensen มีแป้งมันฝรั่งแอสพาราจีนแมกนีเซียมซิเตรตโมโนโพแทสเซียมฟอสเฟตแมกนีเซียมซัลเฟตมาลาไคต์กรีนกรดนาลิดิซิคไซโคลเฮกซิไมด์ลินโคไมซินไข่ตีกลีเซอรีนและน้ำ

โดยปกติแล้วไมโคแบคทีเรียจะแยกได้จากบริเวณที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อเช่นเสมหะปัสสาวะฝีเป็นต้น ซึ่งหมายความว่าตัวอย่างส่วนใหญ่จะมีไมโครไบโอต้าตามปกติของพื้นที่รวมทั้งเชื้อโรค

นั่นคือเหตุผลที่สื่อLöwenstein-Jensen มีชุดของสารยับยั้งในองค์ประกอบที่แสดงโดย malachite green ยาปฏิชีวนะและ antifungals

นอกจากนี้ตัวอย่างที่มาจากสถานที่ที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อจะต้องได้รับการขจัดสิ่งปนเปื้อนและทำให้เป็นกลางก่อนนำไปเพาะในอาหารLöwenstein-Jensen

รากฐาน

การปรากฏตัวของไข่และกลีเซอรีนในอาหารLöwenstein-Jensen ช่วยกระตุ้นการเจริญเติบโตของมัยโคแบคทีเรียเนื่องจากมีกรดไขมันและโปรตีนที่จำเป็นสำหรับการพัฒนาจุลินทรีย์เหล่านี้

สื่อLöwenstein-Jensen ประกอบด้วยมาลาไคต์กรีนซึ่งเป็นตัวยับยั้งไมโครไบโอต้าที่มาพร้อมกัน แต่ยังมีกรด nalidixic (35 µg / mL) ซึ่งยับยั้งไมโครไบโอตาแกรมลบไซโคลเฮซิไมด์ (400 µg / mL) ซึ่งยับยั้งเชื้อราและยีสต์ saprophytic และ lincomycin (2 µ / mL) ซึ่งยับยั้งไมโครไบโอตาแกรมบวก

อาคารพาณิชย์บางแห่งต้องการเพิ่มยาปฏิชีวนะร่วมกันดังต่อไปนี้: polymyxin B 200,000 หน่วย / L, amphotericin B 10 มก. / ลิตร, คาร์เบนิซิลลิน 50 มก. / ลิตรและไตรเมโธพริม 10 มก. / ลิตร

ตัวกลางนี้ไม่มีวุ้นดังนั้นการแข็งตัวของตัวกลางเกิดขึ้นเนื่องจากการแข็งตัวของอัลบูมินที่มีอยู่ในไข่ระหว่างการฆ่าเชื้อ

การจัดเตรียม

น้ำหนัก 37.3 กรัมของตัวกลางที่ขาดน้ำในน้ำกลั่น 600 มล. ซึ่งก่อนหน้านี้เติมกลีเซอรอล 12 มล. ส่วนผสมถูกทำให้ร้อนกวนบ่อย ๆ จนละลายหมด นึ่งในอุณหภูมิ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที

ในทางกลับกันควรเตรียมไข่สด 1,000 มล. ให้เป็นเนื้อเดียวกันภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ เติมสารแขวนลอยไข่ลงในอาหารขนาด 600 มล. ที่เตรียมไว้ที่อุณหภูมิ 50 - 60 ° C หลีกเลี่ยงฟองอากาศ

นอกจากนี้ยังมีการเพิ่มสารละลายยาปฏิชีวนะหลังจากการฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งความดัน

เทสื่อลงในหลอดทดลองที่หุ้มด้วยเกลียวที่ปราศจากเชื้อ ให้ความร้อนหลอดที่ 85 ° C เป็นเวลา 45 นาทีในตำแหน่งที่เอียง

สีของตัวกลางที่เตรียมไว้คือสีเขียวอะความารีนและอาจมีจุดสีขาวเนื่องจากมีไขมันในไข่

pH ของตัวกลางต้องเป็น 7.2 ± 0.2

เก็บหลอดไว้ในตู้เย็นและป้องกันไม่ให้โดนแสงโดยตรงจนกว่าจะใช้งาน อุณหภูมิก่อนหว่าน

มีการดัดแปลงสื่อที่เรียกว่า "Gruft modified of the Löwenstein Jensen" ซึ่งประกอบด้วยสารประกอบเดียวกันกับตัวกลางคลาสสิก แต่มีการเพิ่ม RNA-5mg / 100 mL และในฐานะที่เป็นสารยับยั้งจะมี malachite green 0.025 g / 100 mL, penicillin 50 U / mL และ nalidixic acid 35 ug / mL

การประยุกต์ใช้งาน

Löwenstein-Jensen medium ใช้สำหรับการแยก mycobacteria จากตัวอย่างประเภทต่างๆ แนะนำให้ใช้คราบ Ziehl-Neelsen สำหรับตัวอย่างใด ๆ ที่สงสัยว่ามีเชื้อมัยโคแบคทีเรีย

ตัวอย่างบางส่วนมาจากสถานที่ปลอดเชื้อ แต่บางตัวอย่างไม่มี ตัวอย่างที่ไม่ผ่านการฆ่าเชื้อต้องได้รับการปนเปื้อนตามความเหมาะสม:

เสมหะ

ตัวอย่างเสมหะควรได้รับการขจัดสิ่งปนเปื้อนดังนี้กำหนดจำนวนตัวอย่างเสมหะเป็นมิลลิลิตรและเติม NaOH 4% ในปริมาณเท่ากันลงในตัวอย่างและบ่มที่อุณหภูมิ 37 ° C

เขย่าส่วนผสมบ่อยๆภายใน 30 นาที ต่อมาหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที

ทิ้งส่วนที่เหนือกว่าด้วยสารละลายฆ่าเชื้อฟีนอลิก ใช้ตะกอนในการหว่าน แต่ก่อนอื่นต้องปรับ pH ให้เป็นกลาง

ในการทำให้ตะกอนเป็นกลาง5% H ₂ SO ₄จะถูกใช้ต่อหน้าตัวบ่งชี้สีแดงของฟีนอลจนกว่าจะถึง pH ที่เป็นกลางซึ่งทำให้เกิดสีปลาแซลมอน

การล้างกระเพาะการล้างหลอดลมและการดูดหลอดลม

ในกรณีนี้ตัวอย่างจะต้องหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที ส่วนเหนือตะกอนจะถูกทิ้งและใช้เม็ด ในการขจัดสิ่งปนเปื้อนของตะกอนให้เติม NaOH 4% 3 มล. และคนบ่อยๆที่อุณหภูมิ 37 ° C เป็นเวลาครึ่งชั่วโมง

เครื่องหมุนเหวี่ยงอีกครั้งส่วนเหนือตะกอนจะถูกทิ้งและใช้เม็ด หลังต้องถูกทำให้เป็นกลางตามที่อธิบายไว้ในตัวอย่างเสมหะ

ปัสสาวะ

ปล่อยให้ตัวอย่างตกตะกอนในตู้เย็นเป็นเวลา 24 ชั่วโมง แยกส่วนเหนือตะกอน เม็ดที่เหลือควรหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา 30 นาทีที่ 3000 RMP ทิ้งส่วนเหนือตะกอนอีกครั้งและสร้างเม็ดใหม่ด้วยสารละลายทางสรีรวิทยาที่ปราศจากเชื้อ 3 มล.

เติม NaOH 4% 3 มล. และดำเนินการขจัดสิ่งปนเปื้อนและการทำให้เป็นกลางตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้

น้ำในช่องท้องน้ำเยื่อหุ้มปอดน้ำไขสันหลัง

ในตัวอย่างประเภทนี้จะถูกหมุนเหวี่ยงและส่วนเหนือตะกอนจะถูกทิ้ง ทำการแกรมบนตะกอนหรือสังเกตโดยตรงภายใต้กล้องจุลทรรศน์ หากไม่พบแบคทีเรียขั้นตอนการปนเปื้อนก็ไม่จำเป็นและไม่ใช่ขั้นตอนการทำให้เป็นกลาง

ในกรณีนี้สามารถเพาะเมล็ดได้โดยตรงโดยใช้ตะกอน หากมีแบคทีเรียให้ทำการกำจัดสิ่งปนเปื้อนและทำให้เป็นกลางตามที่อธิบายไว้ข้างต้น

ขริบ

สำหรับตัวอย่างประเภทนี้ต้องเติมน้ำกลั่น 5 มล. ลงในเครื่องปั่นแยกในภายหลังที่ 1500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาที ทิ้งส่วนเหนือตะกอนแล้วปั่นแยกเม็ดอีกครั้งที่ 3500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 30 นาที ใช้ตะกอนหว่านอาหารเลี้ยงเชื้อ

ไม้กวาดกล่องเสียง

ควรวางไม้กวาดในหลอดที่ปราศจากเชื้อซึ่งมีน้ำกลั่นเท่า ๆ กันและ NaOH 4% ต้องกดไม้กวาดกับผนังของท่อเพื่อให้ตัวอย่างเจือจางในของเหลว เครื่องปั่นเหวี่ยงและใช้ตะกอน ทำให้ตะกอนเป็นกลางตามที่อธิบายไว้แล้ว

หว่าน

ตัวกลางLöwenstein-Jensen ได้รับการฉีดวัคซีนโดยการเติมตัวอย่าง 0.5 มล. ลงบนพื้นผิวของตัวกลาง หมุนหลอดเพื่อกระจายตัวอย่างไปทั่วตัวกลาง อย่าใช้ที่จับแพลตตินั่ม

หลอดที่สองที่มีตัวกลาง Stonebrink สามารถเพาะเพื่อแยกเชื้อ Mycobacterium bovis และสายพันธุ์อื่น ๆ ที่ไม่เติบโตบนอาหารLöwenstein-Jensen

การบ่ม

หลอดฉีดวัคซีนจะถูกบ่มแบบแอโรบิคที่อุณหภูมิ 37 ° C โดยที่ฝาปิดหลวมเล็กน้อยและเอียงประมาณ 5 °และป้องกันจากแสง สภาพแวดล้อมสามารถอุดมไปด้วยคาร์บอนไดออกไซด์ 5-10% ตรวจสอบวัฒนธรรมสัปดาห์ละสองครั้งจนกว่าอาณานิคมจะปรากฏขึ้น

เมื่อตัวอย่างถูกดูดซับแล้วแคปจะถูกขันให้แน่น ระยะฟักตัวสูงสุดคือ 8 สัปดาห์หากหลังจากนี้ไม่มีการเจริญเติบโตจะรายงานว่าเป็นลบ

ระบบประกันคุณภาพ

สามารถใช้สายพันธุ์ต่อไปนี้เป็นการควบคุมคุณภาพ:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, StreptocCoccus pyogenes 32061 ATCCptococcus 32061 ATCCptococcus 32061

คาดว่าจะมีการพัฒนาที่ดีเยี่ยมสำหรับสามชนิดแรกที่กล่าวถึงสำหรับการเจริญเติบโตของ M. fortuitum ควรจะดีในขณะที่ M. bovis คาดว่าจะเติบโตเพียงเล็กน้อยหรือไม่มีเลย ในขณะเดียวกันสิ่งมีชีวิตชนิดอื่นที่ไม่ใช่ Mycobacterium จะต้องถูกยับยั้งอย่างเต็มที่

ข้อ จำกัด

สื่อที่เตรียมไว้จะต้องได้รับการปกป้องจากแสงการเปิดรับแสงเป็นเวลานานทำให้ตัวกลางเปลี่ยนจากสีเขียวเป็นสีน้ำเงินในกรณีนี้จะไม่สามารถใช้สื่อได้อีกต่อไป เนื่องจากมาลาไคต์กรีนมีความไวแสง

อาหารที่มีไข่สามารถปนเปื้อนได้ง่ายหากไม่ได้รับการจัดการอย่างปลอดเชื้อ สามารถละลายได้หากปนเปื้อนด้วยแบคทีเรียโปรตีโอไลติก

การเพาะปลูกและการจัดการแบคทีเรียในสกุล Mycobacterium ต้องการบุคลากรที่มีคุณสมบัติเหมาะสมซึ่งตระหนักถึงมาตรการความปลอดภัยทางชีวภาพที่ต้องปฏิบัติตามเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนหรือปนเปื้อนผู้อื่น

ไม่ควรใช้ HCl ในขั้นตอนการทำให้เป็นกลางเนื่องจากการก่อตัวของโซเดียมคลอไรด์ซึ่งอาจเป็นพิษต่อบาซิลลัสของ Koch

ควรเก็บตัวอย่างไว้ในตู้เย็นและป้องกันไม่ให้ถูกแสงในขณะที่ไม่ผ่านกระบวนการ

การอ้างอิง

ห้องปฏิบัติการ Francisco Soria Melguizo 2552. สื่อคัดเลือกLöwenstein-Jensen. มีจำหน่ายที่: f-soria.es
Britannia Laboratories 2560. Löwenstein-Jensen medium. มีให้ที่: britanialab.com
ห้องปฏิบัติการนีโอเจน กลางLöwenstein-Jensen มีจำหน่ายที่: foodsafety.neogen.com
"Löwenstein-Jensen medium" Wikipedia สารานุกรมเสรี 20 พ.ย. 2561, 15:15 น. UTC. 24 เม.ย. 2562, 18:34 น. wikipedia.org
Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา 5th ed. กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
Mac Faddin J. (2003). การทดสอบทางชีวเคมีเพื่อระบุแบคทีเรียที่มีความสำคัญทางคลินิก 3rd ed. กองบรรณาธิการ Panamericana บัวโนสไอเรส. อาร์เจนตินา.

LÖWENSTEIN-JENSEN MEDIUM: รองพื้นการเตรียมและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2026