การติดเชื้อแบคทีเรีย: ลักษณะและการเตรียม - ชีววิทยา - 2025

การสเมียร์ของแบคทีเรียเป็นฟิล์มบาง ๆ ของสารแขวนลอยของจุลินทรีย์แบคทีเรียที่ทำบนแผ่นกระจกใสหรือสไลด์สำหรับการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง

การขยายในรูปแบบของฟิล์มจะดำเนินการเพื่อแยกจุลินทรีย์ให้ได้มากที่สุดเนื่องจากหากมีการจัดกลุ่มการสังเกตจะไม่ชัดเจน

รูปที่ 1. รอยเปื้อนแบคทีเรียที่เห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด ที่มา: pixbay.com

ในการศึกษาวัฒนธรรมของแบคทีเรียจะใช้เทคนิคการเตรียมสเมียร์การตรึงและการย้อมสีเพื่อวิเคราะห์ได้ดีขึ้น เนื่องจากจุลินทรีย์มีขนาดเล็กจึงจำเป็นต้องใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงในการสังเกต

กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงเป็นเครื่องมือสำคัญในการสังเกตรอยเปื้อน เลนส์เหล่านี้ใช้เลนส์ออพติคอลและแสงเพื่อให้สามารถดูตัวอย่างด้วยกำลังขยายสูง

โดยทั่วไปเซลล์ของสิ่งมีชีวิตไม่มีโครงสร้างสีส่วนใหญ่มองเห็นได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงพวกมันไม่มีสีเป็นตัวอย่างโปร่งใสและแสดงความเปรียบต่างภายในน้อยมากและด้วยสภาพแวดล้อมของมัน

การสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์แสงสนามอย่างง่ายโดยไม่ต้องใช้เทคนิคการย้อมสีเสริมมีข้อ จำกัด มากและใช้ในบางกรณีเท่านั้นเช่นในการสังเกตการเคลื่อนที่ของจุลินทรีย์

เพื่อการสังเกตจุลินทรีย์ที่ดีที่สุดจะต้องสร้างสมดุลระหว่างความคมชัดและความละเอียด ไม่สามารถมองเห็นรายละเอียดของเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แม้จะมีความละเอียดสูงก็ตาม จำเป็นต้องใช้สีย้อมผ่านเทคนิคการย้อมสีซึ่งให้ความเปรียบต่างสำหรับการสังเกต

ลักษณะของสเมียร์แบคทีเรียคุณภาพดี

ความคมชัดที่ยอดเยี่ยม

เพื่อให้ได้คอนทราสต์ที่ยอดเยี่ยมมีกล้องจุลทรรศน์ที่มีความซับซ้อนซึ่งเรียกว่ากล้องจุลทรรศน์คอนทราสต์เฟส, กล้องจุลทรรศน์สัญญาณรบกวนที่แตกต่างกันและกล้องจุลทรรศน์สนามมืด กล้องจุลทรรศน์ชนิดนี้ใช้เพื่อสังเกตโครงสร้างของแบคทีเรียเช่นปลอกและเส้นใยเป็นต้น

การย้อมสีเป็นเทคนิคง่ายๆในการเพิ่มคอนทราสต์ที่ทำได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์ไบร์ทฟิลด์ ในเทคนิคนี้สามารถใช้คราบต่าง ๆ ซึ่งช่วยปรับปรุงการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้อย่างมีนัยสำคัญ

คราบจะเกิดขึ้นโดยตรงกับรอยเปื้อนหรือส่วนขยายของสารแขวนลอยของจุลินทรีย์บนสไลด์ซึ่งก่อนหน้านี้ทำให้แห้งและคงที่

การแก้ไขที่ดี

การตรึงเป็นเทคนิคที่ใช้ในการรักษาโครงสร้างของเซลล์ ทำให้เกิดการหยุดการทำงานของจุลินทรีย์และการยึดติดกับกระจกของสไลด์ มีวิธีการแก้ไขที่แตกต่างกัน: การตรึงความร้อนและการตรึงสารเคมี

การตรึงความร้อน

นี่เป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการสังเกตรอยเปื้อนของแบคทีเรีย เทคนิคนี้ประกอบด้วยการส่งสารแขวนลอยของแบคทีเรียผ่านเปลวไฟของไฟแช็ก เทคนิคนี้สามารถรักษาสัณฐานวิทยาภายนอกของแบคทีเรีย แต่ทำลายโครงสร้างภายในของแบคทีเรีย

การตรึงสารเคมี

การตรึงทางเคมีใช้สารเคมีในการถนอมอาหารเช่นฟอร์มาลดีไฮด์หรือฟอร์มาลินเอทานอลและกรดอะซิติกเป็นต้น ข้อดีของการใช้สารตรึงเคมีคือการรักษาโครงสร้างเซลล์ภายในของจุลินทรีย์ทำได้สำเร็จ

รูปที่ 2. เลือดเปื้อน ที่มา: Bobjgalindo จาก Wikimedia Commons

การย้อมสีที่ดี

ขั้นตอนที่พบบ่อยที่สุดสำหรับการย้อมสีสเมียร์ที่แห้งก่อนหน้านี้และคงที่คือการย้อมสีแบบบวกหรือแบบธรรมดาการย้อมสีที่แตกต่างกันและการย้อมสีลบ นอกจากนี้ยังมีเทคนิคพิเศษสำหรับการย้อมสีโครงสร้างของเซลล์โดยเฉพาะ (แคปซูลสปอร์แฟลกเจลลา)

การย้อมสีในเชิงบวกหรือการย้อมสีแบบธรรมดา

การย้อมสีแบบบวกหรือแบบธรรมดาเป็นเทคนิคการย้อมสีแบบสเมียร์ที่ใช้กันอย่างแพร่หลาย ใช้สีย้อมที่มีความสามารถในการจับกับโครงสร้างจุลินทรีย์บางชนิดทำให้สามารถสังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์

สีย้อมเหล่านี้มีกลุ่มโครโมโซม (ส่วนที่มีสี) ในโครงสร้างทางเคมีโดยมีพันธะคู่สลับกันและพันธะเดี่ยว (การผันคำกริยา) พันธะเหล่านี้สามารถสร้างพันธะไอออนิกหรือโควาเลนต์กับโครงสร้างเซลล์บางชนิดได้

สีย้อมที่ใช้ในการย้อมสีแบบบวกหรือแบบธรรมดาส่วนใหญ่เป็นอนุพันธ์ทางเคมีของอนิลีน (เกลืออินทรีย์ที่มีสี)

ในทางกลับกันในบรรดาสีย้อมเราสามารถพบได้บางชนิดที่มีค่า pH พื้นฐานและอื่น ๆ ที่มี pH เป็นกรด

สีพื้นฐาน

ในสีย้อมพื้นฐานกลุ่มโครโมฟอร์มีประจุไฟฟ้าเป็นบวก จุลินทรีย์โปรคาริโอตส่วนใหญ่มีค่า pH ภายในที่เป็นกลางและพื้นผิวของเซลล์มีประจุลบ ด้วยปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตนี้โครโมโซมจะจับกับเซลล์และทำให้เกิดคราบ

ตัวอย่างของสีย้อมพื้นฐาน ได้แก่ เมทิลีนบลูคริสตัลไวโอเลตสีเขียวมาลาไคต์ฟูซินพื้นฐานซาฟรานินและอื่น ๆ

สีย้อมกรด

ในสีย้อมกรดกลุ่มโครโมฟอร์มีประจุไฟฟ้าลบ สิ่งเหล่านี้ใช้ในการย้อมสีโปรตีนที่มีหมู่อะมิโนที่มีประจุบวก ตัวอย่างของสีย้อมกรด ได้แก่ กรดฟูซินกุหลาบเบงกอลคองโกแดงและอีโอซิน

การย้อมสีที่แตกต่างกัน

เทคนิคการย้อมสีที่แตกต่างกันประกอบด้วยการใช้สีย้อมสองสีที่มีสีหรือความเข้มต่างกันเพื่อแยกแยะจุลินทรีย์ที่แตกต่างกันภายใต้กล้องจุลทรรศน์ คราบแกรมและคราบความต้านทานกรด - แอลกอฮอล์เป็นคราบที่แตกต่างกันที่ใช้บ่อยที่สุดในแบคทีเรียวิทยา

คราบแกรมถูกใช้เป็นการทดสอบเบื้องต้นเพื่อให้ทราบถึงรูปร่างขนาดการจัดกลุ่มเซลล์ตลอดจนชนิดของผนังเซลล์ การใช้การทดสอบคราบแกรมแบคทีเรียที่ผนังเซลล์แบ่งออกเป็นแบคทีเรียแกรมบวกและแบคทีเรียแกรมลบ

การย้อมสีเชิงลบ

ในเทคนิคนี้จะใช้สารให้สีทางเคมีที่ไม่ซึมเข้าไปภายในเซลล์ แต่ทำให้ตัวกลางที่จุลินทรีย์ปรากฏเป็นพื้นหลังสีดำ

ในเทคนิคการย้อมสีเชิงลบสเมียร์ทำจากหยดหมึกอินเดียหรือสารแขวนลอยนิโกรซินซึ่งหลังจากปล่อยให้แห้งที่อุณหภูมิห้องจะกลายเป็นฟิล์มทึบแสงไปยังทางผ่านของแสง ด้วยวิธีนี้จุลินทรีย์จะปรากฏเป็นรูปร่างสดใสบนพื้นหลังสีเข้ม

การจัดเตรียม

ก. ละเลง

1.- ล้างสไลด์ให้สะอาดซับให้แห้งด้วยกระดาษซับและป้าย ฉลากต้องระบุเนื้อหาของการจัดทำวันที่และชื่อของผู้ที่ดำเนินการ

2.- จุดไฟแช็กและฆ่าเชื้อห่วงฉีดวัคซีนในเปลวไฟจนเป็นสีแดงสด

3.- ปล่อยให้ที่จับเย็น

4.- นำหลอดเพาะเชื้อแบคทีเรียถอดฝาออกแล้วรีบลอดปากหลอดไปใกล้เปลวไฟ (เปลวไฟ)

5.- ใส่ห่วงฉีดวัคซีนเข้าไปในท่อที่มีเชื้อแบคทีเรียและเก็บตัวอย่าง

6. - หากวัฒนธรรมอยู่ในของเหลวให้วางตัวอย่างที่ถ่ายด้วยมือจับตรงกลางสไลด์และเกลี่ยอย่างระมัดระวังเป็นวงกลมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 2 ซม.

7.- ฆ่าเชื้อลูปฉีดวัคซีนอีกครั้ง

8.- ปล่อยให้สเมียร์แห้งในอากาศ

9.- ทำซ้ำขั้นตอนที่ 3 ถึง 8 สามครั้ง

10.- หากวัฒนธรรมอยู่ในสภาพแข็งต้องวางน้ำกลั่นหยดลงบนสไลด์ก่อนหน้านี้ สิ่งนี้ทำเพื่อผสมตัวอย่างเล็ก ๆ ของวัฒนธรรมที่ถ่ายกับวงจรการฉีดวัคซีนตามที่กำหนดไว้ในขั้นตอนที่ 2 ถึง 5 (สภาวะปลอดเชื้อ)

11.- กระจายตัวอย่างที่เจือจางด้วยหยดน้ำบนสไลด์แล้วทำซ้ำสามครั้ง

ข. การตรึง

1. - เติมเมทานอลหรือเอทานอลสัมบูรณ์สองหยดลงในสเมียร์แห้ง - จากวัฒนธรรมในตัวกลางที่เป็นของเหลว -

2.- ปล่อยให้อากาศแห้งห่างจากไฟแช็ก

3. - หากสเมียร์มาจากการเพาะเชื้อบนตัวกลางที่เป็นของแข็งสเมียร์แห้งจะถูกยึดด้วยความร้อนโดยส่งผ่านไปอย่างรวดเร็ว 2-3 ครั้งผ่านส่วนที่ร้อนที่สุดของเปลวไฟที่เบากว่า

4.- แตะส่วนล่างของรอยเปื้อนกับส่วนหลังของมือซ้าย (สำหรับคนถนัดขวาหรือใช้มือขวา) และตรวจสอบว่ามันเย็น

C. การย้อมสีแบบธรรมดา

1. - หยดคราบที่เลือกไว้ 2 หยดลงในสเมียร์และปล่อยทิ้งไว้ตามเวลาที่กำหนดในโปรโตคอลเฉพาะสำหรับแต่ละคราบ (โดยทั่วไปจะอยู่ระหว่าง 1 ถึง 5 นาที)

2.- คราบบางอย่างต้องใช้ความร้อนในการกระตุ้นซึ่งในกรณีนี้จำเป็นต้องใช้ความระมัดระวังเป็นอย่างมากเมื่อให้ความร้อนสไลด์ในเปลวไฟที่เบากว่า (จัดการด้วยแหนบและหลีกเลี่ยงการเดือด) ความร้อนสูงเกินไปสเมียร์สามารถทำลายเซลล์ที่สังเกตได้

3.- ขจัดสีส่วนเกินโดยล้างด้วยน้ำกลั่นจากปิเปต นำน้ำล้างออกโดยค่อยๆแตะสไลด์ที่ขอบเอียงบนโต๊ะทำงาน

4.- ปล่อยให้อากาศแห้ง

5.- ขึ้นอยู่กับประเภทของการสังเกตจะมีการใช้ฝาปิดหรือไม่ในขั้นตอนนี้ ฝาปิดช่วยปกป้องและรักษารอยเปื้อน หากทำการสังเกตการแช่น้ำมันในขั้นตอนนี้จะไม่มีการใช้ฝาปิด แต่ไม่สามารถเก็บรักษารอยเปื้อนได้

D. การเก็บรักษาสเมียร์ขั้นสุดท้าย

1. - จุ่มสเมียร์อย่างต่อเนื่องในแต่ละวิธีที่ระบุด้านล่างเป็นเวลาอย่างน้อย 5 นาที จุดประสงค์ของ "ห้องอาบน้ำ" เหล่านี้คือการทำให้สเมียร์หมดน้ำ น้ำยาแต่ละตัวควรระบายออกให้หมดก่อนนำสเมียร์ไปอาบน้ำครั้งต่อไป

ลำดับของการอาบน้ำที่ขาดน้ำมีดังนี้:

1. เอทานอล 70%
2. เอทานอล 95%
3. อะซิโตนบริสุทธิ์
4. ส่วนผสมของ Acetone -xylol 1: 1
5. Xylol

จากนั้นปล่อยให้อากาศแห้ง

2. - ติดตั้งฝาปิดโดยเฉพาะอย่างยิ่ง 22 × 22 มม. โดยใช้ยาหม่องแคนาดาหรือวัสดุยึดอื่น ๆ

อ้างอิง

1. บริกส์กรัม (2508). สาเหตุปัจจัยในอุบัติเหตุและการติดเชื้อในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ห้องปฏิบัติการทางชีววิทยาของกองทัพสหรัฐฯ ป้อม Detrick
2. Cappucino, JG and Welch, CT (2017) จุลชีววิทยา: คู่มือห้องปฏิบัติการ. เพียร์สัน
3. Holt บรรณาธิการ JG (1977) คู่มือของ Bergey ที่สั้นลงสำหรับการกำหนดแบคทีเรีย 8 ^THบัลติมอร์: วิลเลียมส์และวิลกินส์ จำกัด
4. Johnson, TR และ Case; ซีแอล (2018). การทดลองในห้องปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา. เพียร์สัน
5. Tille, P. (2017). จุลชีววิทยาวินิจฉัย. 14 ^THเซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา: Elsiever, Inc