ลูกปัดวุ้นมาตรฐาน: เหตุผลการเตรียมและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2024

นับวุ้นมาตรฐานเป็นของแข็งกลางวัฒนธรรมไม่เลือกที่ออกแบบมาสำหรับปริมาณของแอโรบิกโหลดปัจจุบันจุลินทรีย์ในตัวอย่างของการดื่มน้ำ, น้ำเสีย, เครื่องดื่มนมในหมู่อาหารอื่น ๆ สื่อนี้เรียกอีกอย่างว่า PCA agar ซึ่งเป็นตัวย่อในภาษาอังกฤษ Plate Count Agar สร้างขึ้นในปีพ. ศ. 2496 โดย Buchbinder, Baris และ Goldstein

อาหารเลี้ยงเชื้อมาตรฐานประกอบด้วยสารสกัดจากยีสต์ไตรปไทน์กลูโคสวุ้นและน้ำกลั่น สูตรนี้ประกอบด้วยองค์ประกอบทางโภชนาการขั้นพื้นฐานที่อนุญาตให้มีการพัฒนาปริมาณจุลินทรีย์แบบแอโรบิคในปัจจุบันโดยไม่เรียกร้อง

การเจือจางทศนิยมสำหรับการนับ CFU ในการนับวุ้นมาตรฐาน ที่มา: Quentin Geissmann

เนื่องจากตัวกลางไม่มีสารยับยั้งแบคทีเรียจึงสามารถเจริญเติบโตได้โดยไม่มีข้อ จำกัด จึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการนับจำนวนอาณานิคมทั่วไป อย่างไรก็ตามเทคนิคการหาปริมาณคราบจุลินทรีย์จะไม่สามารถตรวจพบแบคทีเรียทั้งหมดที่มีอยู่ แต่จะมีเพียงแบคทีเรียที่สามารถเจริญเติบโตได้ภายใต้สภาวะแวดล้อมที่ต้องอยู่ภายใต้มาตรฐานการนับวุ้น

ในแง่นี้เทคนิคการหาปริมาณเพลตโดยทั่วไปจะพยายามกำหนดปริมาณแบคทีเรียประเภทเมโซฟิลิกแบบแอโรบิคนั่นคือพวกที่เติบโตที่อุณหภูมิระหว่าง 25 ถึง 40 ° C โดยมีอุณหภูมิการเจริญเติบโตที่เหมาะสมที่ 37 ° C .

แบคทีเรียกลุ่มนี้มีความสำคัญมากเนื่องจากพบแบคทีเรียก่อโรคสำหรับมนุษย์ส่วนใหญ่

ควรสังเกตว่าบางครั้งอาจเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะหาปริมาณของแบคทีเรียทางจิตเวชที่มีอยู่ในอาหาร แบคทีเรียเหล่านี้เป็นแบคทีเรียที่เติบโตที่อุณหภูมิต่ำ (<20 ° C) และมีหน้าที่ทำให้อาหารย่อยสลายเร็วขึ้นแม้ว่าจะแช่เย็นก็ตาม

ในทำนองเดียวกันแบคทีเรียที่ทนความร้อนซึ่งพัฒนาในช่วงระหว่าง 50 ° C ถึง 80 ° C หรือมากกว่านั้นอาจมีความสำคัญในอาหารบางประเภทเช่นอาหารกระป๋อง

ปริมาณจุลินทรีย์จะแสดงในหน่วยการสร้างอาณานิคม (CFU) ต่อกรัมหรือมิลลิลิตรของตัวอย่าง

รากฐาน

สื่อนับมาตรฐานได้รับการออกแบบมาเพื่อให้การเจริญเติบโตของแบคทีเรียแอโรบิกที่ไม่จุกจิกเจริญเติบโตได้สำเร็จเนื่องจากสารสกัดจากยีสต์ไตรปไทน์และกลูโคสให้สารอาหารที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที่ดี

ในทางกลับกันสื่อมีสีอ่อนและมีลักษณะโปร่งใสซึ่งเป็นเหตุผลว่าทำไมจึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการสร้างภาพของโคโลนีที่พัฒนาโดยวิธีการเพาะเมล็ดแบบลึก (การเทแผ่น)

การนับจำนวนอาณานิคมด้วยวิธีการเพาะเมล็ดบนพื้นผิวของ Drigalski ก็ทำได้เช่นกัน

เมื่อปริมาณจุลินทรีย์สูงต้องทำการเจือจางทศนิยมของตัวอย่างการศึกษาเพื่อให้สามารถนับ CFU ได้

ควรสังเกตว่าสื่อนี้ได้รับการแนะนำโดย American Public Health Association (APHA) สำหรับการนับ mesophiles แบบแอโรบิค

การจัดเตรียม

หนัก 23.5 กรัมของตัวกลางที่ขาดน้ำและละลายในน้ำกลั่นหนึ่งลิตร ในการละลายอย่างสมบูรณ์ส่วนผสมควรได้รับความร้อนโดยคนบ่อยๆจนเดือด ขั้นตอนย่อยที่ตามมาขึ้นอยู่กับเทคนิคการเพาะเมล็ดที่จะใช้

สำหรับเทคนิคเทแผ่น

แจกจ่ายโดยการจ่าย 12 ถึง 15 มล. ลงในหลอดทดลอง จากนั้นฆ่าเชื้อในหม้อนึ่งที่อุณหภูมิ 121 ° C เป็นเวลา 15 นาที อนุญาตให้แข็งตัวในแนวตั้งในรูปของบล็อก เก็บในตู้เย็นจนกว่าจะใช้

ละลายปลั๊กเมื่อคุณจะใช้งาน เมื่อละลายแล้วให้เก็บไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 44-47 ° C ในขณะที่เตรียมตัวอย่าง

สำหรับการหว่านพื้นผิว

ฆ่าเชื้อสื่อในหม้อนึ่งที่อุณหภูมิ 121 ° C จากนั้นกระจาย 20 มล. ในจานเพาะเชื้อที่ปราศจากเชื้อ ปล่อยให้แข็งตัวกลับด้านและเก็บในตู้เย็นจนกว่าจะใช้

แผ่นอุณหภูมิก่อนใช้ pH ของตัวกลางควรเป็น 7.0 ± 0.2

ใช้

Standard Count Agar ใช้ในเทคนิคการนับแบบเมโซฟิลิกแบบแอโรบิคระหว่างการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาของน้ำและอาหาร จำเป็นต้องมีการนับจำนวน mesophiles แบบแอโรบิคเนื่องจากเป็นตัวกำหนดคุณภาพสุขอนามัยของตัวอย่างที่อยู่ระหว่างการศึกษา

การประยุกต์ใช้เทคนิคนี้ (โดยใช้สื่อนี้) ช่วยให้สามารถมองเห็นภาพมาโครของอาณานิคมที่แยกได้สำหรับการหาปริมาณ

เทคนิคการเทจาน (การเพาะเมล็ดแบบลึก)

-กระบวนการ

เทคนิคประกอบด้วยสิ่งต่อไปนี้:

1) ทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวกันเพื่อกระจายแบคทีเรียที่มีอยู่

2) สารแขวนลอยเริ่มต้นทำในขวดหรือถุงที่ปราศจากเชื้อโดยคำนึงถึงอัตราส่วน 10 กรัมหรือ 10 มล. ของตัวอย่างในสารเจือจาง 90 มล. (10 ^-1 )

3) จากการระงับเริ่มต้นการเจือจางทศนิยมที่เกี่ยวข้องจะถูกสร้างขึ้นตามประเภทของตัวอย่าง Ex: (10 ^-2 10 ^-3 10 ^-4 ) การเจือจางทำด้วยน้ำเปปโตนหรือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต

การทำเช่นนี้ใช้เวลา 1 มิลลิลิตรของการระงับการเริ่มต้นและวางไว้ใน 9 มิลลิลิตรเจือจางต่อเจือจางถ้าจำเป็นขณะนี้การ 1 มิลลิลิตรของ 10 ^-2เจือจางและอื่น ๆ

4) เจือจางอย่างละ 1 มล. แล้วใส่ในจานเพาะเชื้อที่ปราศจากเชื้อ

5) ใส่วุ้นนับมาตรฐานลงในแต่ละจาน 12 ถึง 15 มล. ละลายก่อนหน้านี้และตกตะกอนที่ 44 - 47 ° C

6) ค่อยๆหมุนแผ่นเพื่อกระจายตัวอย่างไปตามวุ้นอย่างสม่ำเสมอและปล่อยให้แข็งตัว

7) คว่ำจานและบ่มที่อุณหภูมิ 37 ° C ในแอโรบิคเป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมง

8) เมื่อสิ้นสุดเวลาแผ่นเปลือกโลกจะถูกตรวจสอบและนับอาณานิคมในการเจือจางที่อนุญาต เพลตที่มีระหว่าง 30 ถึง 300 CFU จะถูกเลือกสำหรับการนับ

การนับสามารถทำได้ด้วยตนเองหรือคุณสามารถใช้อุปกรณ์นับอาณานิคม

ค่าที่อนุญาตต่อมิลลิลิตรของตัวอย่างอาจแตกต่างกันไปในแต่ละประเทศขึ้นอยู่กับกฎระเบียบที่ควบคุม

- การคำนวณ UFC

การคำนวณทั่วไปทำได้โดยใช้สูตรต่อไปนี้:

สูตรสำหรับการคำนวณทั่วไปของปริมาณ CFU ที่มา: National Administration of Medicines, Food and Medical Technology (ANMAT) การวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาของอาหารวิธีการวิเคราะห์อย่างเป็นทางการจุลินทรีย์ตัวบ่งชี้ 2557 เล่ม 3 จำหน่ายที่: anmat.gov.ar

แสดงผลลัพธ์เป็น 1 หรือ 2 หลักคูณด้วยฐานที่เหมาะสม 10 ตัวอย่าง: ถ้าผลที่ได้คือ 16,545 ก็จะถูกปัดเศษขึ้นอยู่กับหลักสาม 17,000 และมันจะถูกแสดงดังต่อไปนี้: 1.7 x 10 4 ตอนนี้ถ้าผลเป็น 16,436 รอบมันถึง 16,000 และแสดง 1.6 x 10 4

เทคนิคการเพาะพื้นผิว

-กระบวนการ

-Inocular 0.1 มล. ของกลุ่มตัวอย่างโดยตรงถ้ามันเป็นของเหลวเริ่มต้นการระงับ 10 ^-1หรือเจือจางติดต่อกัน 10 ^-2 10 ^-3ฯลฯ ในใจกลางของการนับมาตรฐานวุ้นแผ่น

- กระจายตัวอย่างเท่า ๆ กันด้วยไม้พาย Drigalski หรือแท่งแก้วรูปตัว L พักไว้ 10 นาที

- คว่ำจานและบ่มโดยใช้ออกซิเจนที่ 37 ° C เป็นเวลา 24 ถึง 48 ชั่วโมง

- ดำเนินการนับโคโลนีเลือกเพลตที่อยู่ในช่วงระหว่าง 20-250 CFU

- การคำนวณ UFC

สำหรับการคำนวณจะใช้ปัจจัยการเจือจางซึ่งเป็นค่าผกผัน ตัวเลขจะถูกปัดเศษเป็นเลขนัยสำคัญ 2 หลัก (การปัดเศษตามหลักที่สาม) และแสดงเป็นเลขยกกำลังฐาน 10 ตัวอย่างเช่นถ้านับ 224 CFU ในตัวอย่างโดยไม่มีการเจือจาง (10 ^-1 ) จะมีการรายงาน22 x 10 ¹ CFU แต่ถ้าตัวเลขเป็น 225 จะมีการรายงาน23 x 10 ¹ CFU

ตอนนี้ถ้านับ 199 CFU ในการเจือจาง 10 ^-3จะมีการรายงาน20 x 10 ⁴ CFU แต่ถ้านับ 153 CFU ในการเจือจางเดียวกันจะมีการรายงาน15 x 10 ⁴ CFU

ระบบประกันคุณภาพ

อาหารเลี้ยงเชื้อสำหรับการนับมาตรฐานสามารถประเมินได้โดยใช้สายพันธุ์ที่ได้รับการรับรองเช่น Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, ATCC Flex22i

หากอาหารเลี้ยงเชื้ออยู่ในสภาวะที่เหมาะสมจะมีการเจริญเติบโตที่น่าพอใจในทุกกรณียกเว้น L. fermentum ซึ่งสามารถให้ผลผลิตได้สม่ำเสมอ

ในการประเมินความเป็นหมันของอาหารเลี้ยงเชื้อควรบ่มหนึ่งหรือสองแผ่นของแต่ละชุดที่เตรียมไว้ (โดยไม่ต้องฉีดวัคซีน) ที่อุณหภูมิ 37 ° C ในแอโรบิคเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากเวลานี้ไม่ควรสังเกตการเจริญเติบโตหรือการเปลี่ยนสีในตัวกลาง

ข้อ จำกัด

- อย่าละลายวุ้นมากกว่าหนึ่งครั้ง

- สื่อที่เตรียมไว้สามารถอยู่ได้นานถึง 3 เดือนตราบเท่าที่เก็บไว้ในตู้เย็นและป้องกันไม่ให้ถูกแสง

- สื่อนี้ไม่เหมาะสำหรับจุลินทรีย์ที่มีความต้องการหรือไม่ใช้ออกซิเจน

อ้างอิง

1. การบริหารยาแห่งชาติอาหารและเทคนิคการแพทย์ (ANMAT) การวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาของอาหารวิธีการวิเคราะห์อย่างเป็นทางการจุลินทรีย์ตัวบ่งชี้ 2557 เล่ม 3 จำหน่ายที่: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar 2552 ดูได้ที่: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard Method Agar (PCA) ตาม APHA และ ISO 4833 ดูได้ที่: condalab.com
4. Britannia Laboratories จำนวนแผ่นวุ้น 2558 ดูได้ที่: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B และVelázquez O. 2009. เทคนิคการวิเคราะห์ทางจุลชีววิทยาของอาหาร. 2nd ed. คณะเคมี UNAM. เม็กซิโก มีจำหน่ายที่: depa.fquim.unam