เอนไซม์ที่ จำกัด : หน้าที่ประเภทและตัวอย่าง - ชีววิทยา

เอนไซม์ข้อ จำกัดที่มีการจ้างงานโดย endonucleases เคีบางและแบคทีเรียในการยับยั้งหรือ "จำกัด" การแพร่กระจายของไวรัสที่อยู่ภายใน โดยเฉพาะอย่างยิ่งในแบคทีเรียและเป็นส่วนหนึ่งของระบบป้องกันดีเอ็นเอจากต่างประเทศที่เรียกว่าระบบ จำกัด / ปรับเปลี่ยน

เอนไซม์เหล่านี้เร่งความแตกแยกของดีเอ็นเอสองแถบในตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจงทำซ้ำได้และไม่ต้องใช้พลังงานเพิ่มเติม ส่วนใหญ่ต้องการปัจจัยร่วมเช่นแมกนีเซียมหรือไอออนบวกอื่น ๆ แม้ว่าบางชนิดจะต้องการ ATP หรือ S-adenosyl methionine

โครงการปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ จำกัด HindIII (ที่มา: Helixitta ผ่าน Wikimedia Commons)

เอ็นโดนิวคลีเอสแบบ จำกัด ถูกค้นพบในปี 1978 โดย Daniel Nathans, Arber Werner และ Hamilton Smith ผู้ซึ่งได้รับรางวัลโนเบลสาขาการแพทย์จากการค้นพบ โดยทั่วไปชื่อของพวกมันมาจากสิ่งมีชีวิตที่พวกมันสังเกตเห็นครั้งแรก

เอนไซม์ดังกล่าวถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการพัฒนาวิธีการโคลนดีเอ็นเอและกลวิธีทางอณูชีววิทยาและพันธุวิศวกรรมอื่น ๆ ลักษณะการจดจำลำดับที่เฉพาะเจาะจงและความสามารถในการตัดลำดับใกล้เคียงกับไซต์การจดจำทำให้เป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพในการทดลองทางพันธุกรรม

ชิ้นส่วนที่สร้างขึ้นโดยเอ็นไซม์ จำกัด ที่ทำหน้าที่กับโมเลกุลดีเอ็นเอโดยเฉพาะสามารถนำมาใช้เพื่อสร้าง "แผนที่" ของโมเลกุลดั้งเดิมขึ้นใหม่โดยใช้ข้อมูลเกี่ยวกับไซต์ที่เอนไซม์ตัดดีเอ็นเอ

เอ็นไซม์ที่มีข้อ จำกัด บางชนิดอาจมีตำแหน่งการจดจำเดียวกันบนดีเอ็นเอ แต่ไม่จำเป็นต้องตัดออกด้วยวิธีเดียวกัน ดังนั้นจึงมีเอนไซม์ที่ตัดปลายทู่และเอนไซม์ที่ตัดปลายที่เหนียวออกซึ่งมีการใช้งานที่แตกต่างกันในอณูชีววิทยา

ปัจจุบันมีเอนไซม์ จำกัด ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดหลายร้อยชนิดซึ่งนำเสนอโดยอาคารพาณิชย์ต่างๆ เอนไซม์เหล่านี้ทำหน้าที่เป็นกรรไกรโมเลกุล "กำหนดเอง" เพื่อวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกัน

คุณสมบัติ

เอนไซม์ที่ จำกัด ทำหน้าที่ตรงข้ามกับโพลีเมอเรสเนื่องจากพวกมันไฮโดรไลซ์หรือทำลายพันธะเอสเตอร์ภายในพันธะฟอสโฟดิสเตอร์ระหว่างนิวคลีโอไทด์ที่อยู่ติดกันในห่วงโซ่นิวคลีโอไทด์

ในอณูชีววิทยาและพันธุวิศวกรรมเป็นเครื่องมือที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการสร้างนิพจน์และการโคลนนิ่งเวกเตอร์เช่นเดียวกับการระบุลำดับเฉพาะ นอกจากนี้ยังมีประโยชน์สำหรับการสร้างจีโนมรีคอมบิแนนท์และมีศักยภาพทางเทคโนโลยีชีวภาพที่ยอดเยี่ยม

ความก้าวหน้าล่าสุดในการบำบัดด้วยยีนทำให้ปัจจุบันมีการใช้เอนไซม์ จำกัด สำหรับการนำยีนบางชนิดเข้าสู่พาหะซึ่งเป็นพาหนะในการขนส่งยีนดังกล่าวไปยังเซลล์ที่มีชีวิตและอาจมีความสามารถในการแทรกเข้าไปในจีโนมของเซลล์เพื่อดำเนินการ การเปลี่ยนแปลงถาวร

กลไกการออกฤทธิ์

เอ็นไซม์ที่ จำกัด สามารถกระตุ้นความแตกแยกของ DNA สองแถบแม้ว่าบางตัวจะสามารถจดจำลำดับดีเอ็นเอแบบวงเดียวและแม้แต่ RNA การตัดเกิดขึ้นหลังจากรับรู้ลำดับ

กลไกการออกฤทธิ์ประกอบด้วยการไฮโดรไลซิสของพันธะฟอสโฟดีสเตอร์ระหว่างกลุ่มฟอสเฟตและดีออกซีไรโบสในโครงกระดูกของดีเอ็นเอแต่ละเส้น เอนไซม์หลายชนิดสามารถตัดในบริเวณเดียวกับที่พวกเขารู้จักในขณะที่เอนไซม์อื่น ๆ ตัดระหว่าง 5 ถึง 9 คู่ฐานก่อนหรือหลัง

โดยปกติเอนไซม์เหล่านี้จะตัดที่ปลาย 5 'ของหมู่ฟอสเฟตทำให้เกิดชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีปลายฟอสโฟรีล 5' และปลายไฮดรอกซิล 3 '

เนื่องจากโปรตีนไม่ได้สัมผัสโดยตรงกับสถานที่รับรู้ใน DNA จึงต้องมีการเปลี่ยนตำแหน่งอย่างต่อเนื่องจนกว่าจะได้ตำแหน่งที่เฉพาะเจาะจงบางทีอาจใช้กลไก "เลื่อน" บนสายดีเอ็นเอ

ในระหว่างความแตกแยกของเอนไซม์พันธะฟอสโฟดีสเตอร์ของแต่ละสายดีเอ็นเอจะอยู่ในตำแหน่งที่ทำงานของเอ็นไซม์ จำกัด เมื่อเอนไซม์ออกจากสถานที่รับรู้และความแตกแยกมันจะทำเช่นนั้นผ่านการเชื่อมโยงชั่วคราวที่ไม่เฉพาะเจาะจง

ประเภท

ปัจจุบันรู้จักเอนไซม์ จำกัด ห้าชนิด นี่คือคำอธิบายสั้น ๆ ของแต่ละรายการ:

เอนไซม์ จำกัด ประเภท I

เอนไซม์เหล่านี้เป็นโปรตีนเพนทาเมอริกขนาดใหญ่ที่มีสามหน่วยย่อยหนึ่งตัวสำหรับการ จำกัด หนึ่งตัวสำหรับเมธิลเลชันและอีกตัวสำหรับการจดจำลำดับในดีเอ็นเอ เอนโดนิวคลีเอสเหล่านี้เป็นโปรตีนมัลติฟังก์ชั่นที่สามารถเร่งปฏิกิริยา จำกัด และปฏิกิริยาการปรับเปลี่ยนพวกมันมีกิจกรรม ATPase และ DNA topoisomerase

เอนไซม์ประเภทนี้เป็นเอนโดนิวคลีเอสชนิดแรกที่ถูกค้นพบโดยถูกทำให้บริสุทธิ์เป็นครั้งแรกในทศวรรษที่ 1960 และได้รับการศึกษาในเชิงลึกตั้งแต่นั้นเป็นต้นมา

เอนไซม์ประเภทที่ 1 ไม่ได้ถูกนำมาใช้เป็นเครื่องมือทางเทคโนโลยีชีวภาพอย่างแพร่หลายเนื่องจากบริเวณรอยแยกสามารถอยู่ในระยะห่างที่แปรผันได้ถึง 1,000 คู่เบสจากไซต์การรับรู้ซึ่งทำให้ไม่น่าเชื่อถือในแง่ของความสามารถในการทำซ้ำในการทดลอง

เอนไซม์ จำกัด Type II

พวกมันเป็นเอนไซม์ที่ประกอบด้วยโฮโมไดเมอร์หรือเตตระเมอร์ที่ตัดดีเอ็นเอในพื้นที่ที่กำหนดไว้ซึ่งมีความยาวระหว่าง 4 ถึง 8 bp โดยทั่วไปไซต์ที่มีความแตกแยกเหล่านี้มักเป็นแบบ palindromic กล่าวคือพวกเขารับรู้ลำดับที่อ่านในลักษณะเดียวกันทั้งสองทิศทาง

เอนไซม์ข้อ จำกัด type II หลายชนิดในแบคทีเรียจะตัด DNA เมื่อพวกมันรับรู้ลักษณะแปลกปลอมของมันเนื่องจากไม่มีการปรับเปลี่ยนตามแบบฉบับที่ DNA ของตัวเองควรมี

เอนไซม์เหล่านี้เป็นเอนไซม์ที่มีข้อ จำกัด ที่ง่ายที่สุดเนื่องจากไม่ต้องการปัจจัยร่วมใด ๆ นอกจากแมกนีเซียม (Mg +) เพื่อรับรู้และตัดลำดับดีเอ็นเอ

ความแม่นยำของเอนไซม์ จำกัด type II ในการรับรู้และตัดลำดับอย่างง่ายใน DNA ในตำแหน่งที่แม่นยำทำให้เป็นหนึ่งในสิ่งที่ใช้กันอย่างแพร่หลายและขาดไม่ได้ในสาขาชีววิทยาระดับโมเลกุลส่วนใหญ่

ภายในกลุ่มของเอนไซม์ข้อ จำกัด Type II มีคลาสย่อยหลายคลาสที่จำแนกตามคุณสมบัติบางอย่างที่ไม่ซ้ำกันสำหรับแต่ละประเภท การจำแนกประเภทของเอนไซม์เหล่านี้ทำได้โดยการเพิ่มตัวอักษรของตัวอักษรจาก A ถึง Z ตามชื่อของเอนไซม์

คลาสย่อยบางคลาสที่รู้จักกันดีในเรื่องประโยชน์ ได้แก่ :

คลาสย่อย IIA

เป็นตัวหรี่ของหน่วยย่อยที่แตกต่างกัน พวกเขารู้จักลำดับที่ไม่สมมาตรและใช้เป็นสารตั้งต้นที่เหมาะสำหรับการสร้างเอนไซม์ตัด

คลาสย่อย IIB

พวกเขาประกอบด้วยตัวหรี่หนึ่งตัวขึ้นไปและตัด DNA ทั้งสองด้านของลำดับการรับรู้ พวกเขาตัด DNA ทั้งสองเส้นออกเป็นช่วงคู่ฐานข้างหน้าไซต์การรับรู้

คลาสย่อย IIC

เอนไซม์ประเภทนี้เป็นโพลีเปปไทด์ที่มีหน้าที่แบ่งและปรับเปลี่ยนสายดีเอ็นเอ เอนไซม์เหล่านี้ตัดทั้งสองเส้นอย่างไม่สมมาตร

คลาสย่อย IIE

เอนไซม์ของคลาสย่อยนี้ถูกใช้มากที่สุดในพันธุวิศวกรรม พวกมันมีไซต์ที่เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาและโดยทั่วไปต้องมีเอฟเฟกต์ออลสเตอริก เอนไซม์เหล่านี้จำเป็นต้องโต้ตอบกับลำดับการรับรู้สองชุดเพื่อดำเนินการแยกที่มีประสิทธิภาพ ภายในคลาสย่อยนี้ ได้แก่ เอนไซม์ EcoRII และ EcoRI

เอนไซม์ จำกัด Type III

เอ็นโดนิวคลีเอสข้อ จำกัด ประเภทที่ 3 ประกอบด้วยหน่วยย่อยเพียงสองหน่วยหน่วยหนึ่งมีหน้าที่ในการรับรู้และปรับเปลี่ยนดีเอ็นเอในขณะที่อีกหน่วยรับผิดชอบในการแยกลำดับ

เอนไซม์เหล่านี้ต้องการปัจจัยร่วมสองตัวสำหรับการทำงาน: ATP และแมกนีเซียม เอ็นไซม์ จำกัด ประเภทนี้มีไซต์การรับรู้ที่ไม่สมมาตรสองแห่งแปลตำแหน่งดีเอ็นเอในลักษณะที่ขึ้นกับ ATP และตัดระหว่าง 20 ถึง 30 bp ที่อยู่ติดกับไซต์การรับรู้

เอนไซม์ จำกัด ประเภท IV

เอนไซม์ Type IV สามารถระบุได้ง่ายเมื่อตัด DNA ด้วยเครื่องหมาย methylation ประกอบด้วยหน่วยย่อยต่างๆหลายหน่วยที่รับผิดชอบในการรับรู้และตัดลำดับดีเอ็นเอ เอนไซม์เหล่านี้ใช้ GTP และแมกนีเซียมดิวาเลนต์เป็นปัจจัยร่วม

บริเวณที่มีรอยแยกเฉพาะ ได้แก่ เส้นนิวคลีโอไทด์ที่มีไซโตซีนที่เป็นเมทิลเลตหรือไฮดรอกซีเมทิลเลตตกค้างบนกรดนิวคลีอิกหนึ่งหรือทั้งสองเส้น

เอนไซม์ จำกัด Type V

การจำแนกประเภทนี้จัดกลุ่มของเอนไซม์ประเภท CRISPER-Cas ซึ่งระบุและตัดลำดับดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงจากสิ่งมีชีวิตที่บุกรุก เอนไซม์ Cas ใช้สาย RNA ที่สังเคราะห์ด้วย CRISPER เพื่อรับรู้และโจมตีสิ่งมีชีวิตที่บุกรุก

เอนไซม์ที่จัดอยู่ในประเภท V เป็นโพลีเปปไทด์ที่มีโครงสร้างโดยเอนไซม์ประเภท I, II และ II พวกเขาสามารถตัดส่วนของ DNA ของสิ่งมีชีวิตเกือบทุกชนิดและมีความยาวได้หลากหลาย ความยืดหยุ่นและความสะดวกในการใช้งานทำให้เอนไซม์เหล่านี้เป็นหนึ่งในเครื่องมือที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในพันธุวิศวกรรมในปัจจุบันพร้อมกับเอนไซม์ประเภท II

ตัวอย่าง

เอ็นไซม์ จำกัด ถูกนำมาใช้ในการตรวจหารูปแบบของดีเอ็นเอโดยเฉพาะอย่างยิ่งในการศึกษาทางพันธุกรรมของประชากรและการศึกษาวิวัฒนาการโดยใช้ดีเอ็นเอไมโทคอนเดรียเพื่อให้ได้ข้อมูลเกี่ยวกับอัตราการทดแทนนิวคลีโอไทด์

ปัจจุบันพาหะที่ใช้ในการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียเพื่อวัตถุประสงค์ต่างๆมีหลายไซต์โคลนซึ่งพบไซต์การจดจำสำหรับเอนไซม์ที่มีข้อ จำกัด หลายชนิด

ในบรรดาเอนไซม์เหล่านี้ที่ได้รับความนิยมมากที่สุด ได้แก่ EcoRI, II, III, IV และ V ซึ่งได้รับและอธิบายเป็นครั้งแรกจาก E. coli; HindIII จาก H. influenzae และ BamHI จาก B. amyloliquefaciens

อ้างอิง

Bickle, TA และ Kruger, DH (1993) ชีววิทยาของการ จำกัด ดีเอ็นเอ Microbiological Reviews, 57 (2), 434–450
Boyaval, P. , Moineau, S. , Romero, DA, & Horvath, P. (2007). CRISPR ให้ความต้านทานต่อไวรัสในโปรคาริโอต Science, 315 (มีนาคม), 1709–1713
กู๊ดเซลล์, D. (2002). มุมมองของโมเลกุล: Endonucleases ข้อ จำกัด Stem Cells Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190–191
Halford, SE (2544). กระโดดกระโดดและวนซ้ำโดยเอนไซม์ จำกัด Biochemical Society Transactions, 29, 363-373
Jeltsch, A. (2003). การรักษาเอกลักษณ์ของสายพันธุ์และการควบคุมการจำแนกแบคทีเรีย: ฟังก์ชั่นใหม่สำหรับระบบ จำกัด / ปรับเปลี่ยน? ยีน 317, 13-16
Krebs, J. , Goldstein, E. , & Kilpatrick, S. (2018). ยีนของ Lewin XII (12 ed.) เบอร์ลิงตันแมสซาชูเซตส์: Jones & Bartlett Learning
Li, Y. , Pan, S. , Zhang, Y. , Ren, M. , Feng, M. , Peng, N. , … She, Q. (2015). การควบคุมระบบ CRISPR-Cas Type I และ Type III สำหรับการแก้ไขจีโนม การวิจัยกรดนิวคลีอิก, 1–12.
Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA, & Wilson, GG (2013) เอนไซม์ จำกัด ประเภท I และญาติของพวกเขา การวิจัยกรดนิวคลีอิก, 1–25
Nathans, D. , & Smith, HO (1975) เอ็นโดนิวคลีเอสที่ จำกัด ในการวิเคราะห์และปรับโครงสร้างโมเลกุลของดีเอ็นเอ Annu รายได้ Biochem , 273–293
Nei, M. , & Tajima, F. (1981). ความหลากหลายของดีเอ็นเอสามารถตรวจพบได้โดยเอ็นโดนิวคลีเอส จำกัด พันธุศาสตร์, 145-163.
Pingoud, A. , Fuxreiter, M. , Pingoud, V. , & Wende, W. (2005). เซลล์และโมเลกุลสิ่งมีชีวิตวิทยาศาสตร์ประเภท II จำกัด เอ็นโดนิวคลีเอส: โครงสร้างและกลไก CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707
โรเบิร์ตส์, อาร์. (2548). เอนไซม์ที่มีข้อ จำกัด กลายเป็นปัจจัยสำคัญของอณูชีววิทยาได้อย่างไร PNAS, 102 (17), 5905–5908
Roberts, RJ, & Murray, K. (1976) เอ็นโดนิวคลีเอส จำกัด Critical Reviews in Biochemistry, (พฤศจิกายน), 123-164.
สตอดดาร์ด, BL (2005). โครงสร้างและหน้าที่ของเอนโดนิวคลีเอส Homing บทวิจารณ์ชีวฟิสิกส์รายไตรมาส 1–47
Tock, MR, & Dryden, DTF (2005) ชีววิทยาของการ จำกัด และการต่อต้านการ จำกัด ความคิดเห็นปัจจุบันทางจุลชีววิทยา, 8, 466–472 https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
Wilson, GG และ Murray, NE (1991) ระบบข้อ จำกัด และการปรับเปลี่ยน Annu รายได้ Genet , 25, 585-627
Wu, Z. , & Mou, K. (2016). ข้อมูลเชิงลึกของจีโนมเกี่ยวกับความรุนแรงของ Campylobacter jejuni และพันธุศาสตร์ประชากร Infec Dis ภาษา Med., 2 (3), 109–119
หยวน, ร. (2524). โครงสร้างและกลไกของเอนโดนิวคลีเอสข้อ จำกัด มัลติฟังก์ชั่น Annu รายได้ Biochem , 50, 285-315

เอนไซม์ที่ จำกัด : หน้าที่ประเภทและตัวอย่าง - ชีววิทยา - 2026