คาริโอไทป์: มีไว้เพื่ออะไรประเภททำอย่างไรการเปลี่ยนแปลง - ชีววิทยา - 2026

สัณฐานเป็นรูปถ่ายของชุดที่สมบูรณ์ของโครโมโซม metaphase ว่ารายละเอียดด้านของจำนวนและโครงสร้างของพวกเขา สาขาวิทยาศาสตร์การแพทย์และชีววิทยาที่เกี่ยวข้องกับการศึกษาโครโมโซมและโรคที่เกี่ยวข้องเรียกว่า cytogenetics

โครโมโซมเป็นโครงสร้างที่มีการจัดระเบียบยีนที่มีอยู่ในโมเลกุลของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก (DNA) ในยูคาริโอตประกอบด้วยโครมาตินซึ่งเป็นโปรตีนฮิสโตนที่ซับซ้อนและดีเอ็นเอที่บรรจุอยู่ภายในนิวเคลียสของเซลล์ทั้งหมด

คาริโอไทป์ของมนุษย์ที่ได้จากสีย้อมเรืองแสง (ที่มา: Plociam ~ commonswiki จาก Wikimedia Commons

เซลล์ของสิ่งมีชีวิตทุกชนิดบนโลกมีโครโมโซมจำนวนเฉพาะ ตัวอย่างเช่นแบคทีเรียมีเพียงวงกลมเดียวในขณะที่มนุษย์มี 46 ตัวใน 23 คู่ และนกบางชนิดมีโครโมโซมมากถึง 80 โครโมโซม

ซึ่งแตกต่างจากมนุษย์โดยทั่วไปเซลล์พืชจะมีโครโมโซมที่เหมือนกัน (เหมือนกัน) มากกว่าสองชุด ปรากฏการณ์นี้เรียกว่า polyploidy

คำแนะนำทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับการเจริญเติบโตและการพัฒนาของสิ่งมีชีวิตไม่ว่าจะเป็นเซลล์เดียวหรือหลายเซลล์มีอยู่ในโมเลกุลของดีเอ็นเอที่ขดอยู่บนโครโมโซม ดังนั้นความสำคัญของการรู้จักโครงสร้างและลักษณะของมันในสายพันธุ์หรือในแต่ละบุคคล

คำว่าคาริโอไทป์ถูกใช้เป็นครั้งแรกในช่วงทศวรรษที่ 1920 โดย Delaunay และ Levitsky เพื่อกำหนดผลรวมของคุณสมบัติทางกายภาพของโครโมโซม ได้แก่ จำนวนขนาดและลักษณะเฉพาะของโครงสร้าง

ตั้งแต่นั้นมาก็ใช้เพื่อวัตถุประสงค์เดียวกันในบริบทของวิทยาศาสตร์สมัยใหม่ และการศึกษานี้มาพร้อมกับกระบวนการต่างๆของการวินิจฉัยทางคลินิกของโรคต่างๆในมนุษย์

คาริโอไทป์ของมนุษย์

ชุดโครโมโซม 46 ชุด (23 คู่) ที่ประกอบกันเป็นจีโนมมนุษย์เรียกว่าคาริโอไทป์ของมนุษย์และมีการจัดเรียงกราฟิกตามลักษณะต่างๆเช่นขนาดและรูปแบบแถบซึ่งเห็นได้ชัดจากการใช้เทคนิคการย้อมสีพิเศษ

แผนผังแสดงคาริโอไทป์ของมนุษย์ (ที่มา: Mikael Häggströmผ่าน Wikimedia Commons)

จากโครโมโซม 23 คู่มีเพียง 1 ถึง 22 เท่านั้นที่จัดเรียงตามขนาด ในเซลล์ร่างกายนั่นคือในเซลล์ที่ไม่มีเพศจะพบ 22 คู่เหล่านี้และขึ้นอยู่กับเพศของแต่ละบุคคลไม่ว่าจะเป็นชายหรือหญิงจะมีการเพิ่มโครโมโซม X คู่ (หญิง) หรือคู่ XY (ชาย) .

คู่ที่ 1 ถึง 22 เรียกว่าโครโมโซมออโตโซมและเหมือนกันในทั้งสองเพศ (ชายและหญิง) ในขณะที่โครโมโซมเพศ X และ Y แตกต่างกัน

คาริโอไทป์มีไว้เพื่ออะไร?

ประโยชน์หลักของคาริโอไทป์คือความรู้โดยละเอียดเกี่ยวกับภาระโครโมโซมของสิ่งมีชีวิตและลักษณะของโครโมโซมแต่ละตัว

แม้ว่าสิ่งมีชีวิตบางชนิดจะมีความหลากหลายและมีความสัมพันธ์กับโครโมโซม แต่ก็มีรูปร่างและจำนวนที่แปรผันตลอดวงจรชีวิตของพวกมันความรู้เกี่ยวกับคาริโอไทป์มักจะช่วยให้เราสามารถสรุปข้อมูลที่สำคัญมากมายเกี่ยวกับพวกมันได้

ต้องขอบคุณคาริโอไทป์ทำให้สามารถวินิจฉัยการเปลี่ยนแปลงของโครโมโซมในระดับ "ขนาดใหญ่" ที่เกี่ยวข้องกับดีเอ็นเอชิ้นใหญ่ได้ ในมนุษย์โรคหรือภาวะพิการทางสมองหลายอย่างและความบกพร่องทางร่างกายอื่น ๆ เกี่ยวข้องกับความผิดปกติของโครโมโซมที่รุนแรง

ประเภทของคาริโอไทป์

คาริโอไทป์อธิบายตามสัญกรณ์ที่รับรองโดย International System of Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN)

ในระบบนี้จำนวนที่กำหนดให้กับโครโมโซมแต่ละตัวจะเกี่ยวข้องกับขนาดของมันและโดยปกติจะเรียงลำดับจากใหญ่ที่สุดไปหาเล็กที่สุด โครโมโซมถูกนำเสนอในคาริโอไทป์เป็นคู่ของโครมาทิดน้องสาวโดยให้แขนเล็ก ๆ (p) หันขึ้น

ประเภทของคาริโอไทป์นั้นแตกต่างกันไปตามเทคนิคที่ใช้เพื่อให้ได้มา โดยปกติแล้วความแตกต่างอยู่ที่ประเภทของการย้อมสีหรือ "การติดฉลาก" ที่ใช้เพื่อแยกความแตกต่างของโครโมโซมหนึ่งจากอีกโครโมโซม

นี่คือสรุปสั้น ๆ ของเทคนิคบางอย่างที่รู้จักกันในปัจจุบัน:

การย้อมสีที่เป็นของแข็ง

ในการนี้ใช้สีย้อมเช่น Giemsa และ orcein เพื่อย้อมสีโครโมโซมให้เท่า ๆ กัน มีการใช้กันอย่างแพร่หลายจนถึงต้นทศวรรษ 1970 เนื่องจากเป็นสีย้อมที่รู้จักกันในเวลานั้น

G-band หรือ Giemsa stain

เป็นเทคนิคที่ใช้มากที่สุดในเซลล์พันธุศาสตร์คลาสสิก โครโมโซมถูกย่อยก่อนหน้านี้ด้วยทริปซินแล้วย้อมสี รูปแบบของแถบที่ได้รับหลังจากการย้อมสีเป็นรูปแบบเฉพาะสำหรับโครโมโซมแต่ละตัวและช่วยให้สามารถศึกษาโครงสร้างของมันโดยละเอียดได้

มีวิธีอื่นในการย้อมสี Giemsa แต่ให้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันมากเช่นแถบ Q และแถบสีย้อนกลับ (โดยแถบสีเข้มที่สังเกตได้คือแถบแสงที่ได้จากแถบ G)

C-band ที่เป็นส่วนประกอบ

โดยเฉพาะคราบ heterochromatin โดยเฉพาะที่พบใน centromeres นอกจากนี้ยังมีคราบวัสดุบางอย่างที่แขนสั้นของโครโมโซมอะโครเซนตริกและบริเวณส่วนปลายของแขนยาวของโครโมโซม Y

แถบการจำลองแบบ

ใช้เพื่อระบุโครโมโซม X ที่ไม่ใช้งานและเกี่ยวข้องกับการเพิ่มนิวคลีโอไทด์อะนาล็อก (BrdU)

คราบเงิน

มีการใช้ในอดีตเพื่อระบุบริเวณองค์กรนิวคลีโอลาร์ที่มีสำเนาของไรโบโซมอลอาร์เอ็นเอจำนวนมากและพบได้ในบริเวณเซนโทรเมอริก

การย้อมสี Distamycin A / DAPI

เป็นเทคนิคการย้อมสีเรืองแสงที่แยกความแตกต่างของเฮเทอโรโครมาตินจากโครโมโซม 1, 9, 15, 16 และจากโครโมโซม Y ในมนุษย์ ใช้โดยเฉพาะอย่างยิ่งเพื่อแยกความแตกต่างของการทำซ้ำโครโมโซมแบบกลับหัว 15

การผสมสารเรืองแสงในแหล่งกำเนิด(FISH)

ได้รับการยอมรับว่าเป็นความก้าวหน้าทางเซลล์สืบพันธุ์ที่ยิ่งใหญ่ที่สุดหลังจากทศวรรษที่ 1990 เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพซึ่งสามารถแยกแยะการลบด้วยกล้องจุลทรรศน์ได้ มันใช้โพรบเรืองแสงที่จับกับโมเลกุลดีเอ็นเอของโครโมโซมโดยเฉพาะและเทคนิคนี้มีหลายรูปแบบ

การผสมพันธ์ของจีโนมเปรียบเทียบ (CGH)

นอกจากนี้ยังใช้โพรบเรืองแสงเพื่อติดฉลาก DNA ที่แตกต่างกัน แต่ใช้มาตรฐานการเปรียบเทียบที่รู้จัก

เทคนิคอื่น ๆ

เทคนิคที่ทันสมัยอื่น ๆ ไม่ได้เกี่ยวข้องโดยตรงกับการวิเคราะห์โครงสร้างโครโมโซม แต่เป็นการศึกษาลำดับดีเอ็นเอโดยตรง ซึ่งรวมถึง microarrays, sequencing และเทคนิคอื่น ๆ ที่อาศัยการขยาย PCR (polymerase chain reaction)

karyotype ดำเนินการอย่างไร?

มีเทคนิคต่างๆในการศึกษาโครโมโซมหรือคาริโอไทป์ บางตัวมีความซับซ้อนมากกว่าแบบอื่นเนื่องจากอนุญาตให้ตรวจจับการเปลี่ยนแปลงที่มองไม่เห็นเล็กน้อยโดยวิธีการที่ใช้บ่อยที่สุด

การวิเคราะห์ทางเซลล์วิทยาเพื่อให้ได้คาริโอไทป์มักดำเนินการจากเซลล์ที่มีอยู่ในเยื่อบุช่องปากหรือในเลือด (โดยใช้ลิมโฟไซต์) ในกรณีของการศึกษาในทารกแรกเกิดตัวอย่างจะถูกนำมาจากน้ำคร่ำ (เทคนิคการรุกราน) หรือจากเซลล์เม็ดเลือดของทารกในครรภ์ (เทคนิคที่ไม่รุกราน)

เหตุผลที่การทำ karyotype มีความหลากหลาย แต่หลายครั้งก็ทำเพื่อวัตถุประสงค์ในการวินิจฉัยโรคการศึกษาภาวะเจริญพันธุ์หรือเพื่อหาสาเหตุของการแท้งซ้ำหรือการเสียชีวิตและมะเร็งของทารกในครรภ์รวมถึงสาเหตุอื่น ๆ

ขั้นตอนในการทดสอบ karyotype มีดังนี้:

1- การได้รับตัวอย่าง (ไม่ว่าจะมาจากแหล่งใดก็ตาม)

2- การแยกเซลล์เป็นขั้นตอนที่สำคัญอย่างยิ่งโดยเฉพาะอย่างยิ่งในตัวอย่างเลือด ในหลายกรณีจำเป็นต้องแยกเซลล์ที่แบ่งออกจากการแบ่งเซลล์โดยใช้สารเคมีชนิดพิเศษ

การเจริญเติบโต 3 เซลล์ บางครั้งจำเป็นต้องปลูกเซลล์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมเพื่อให้ได้ปริมาณที่มากขึ้น อาจใช้เวลามากกว่าสองสามวันขึ้นอยู่กับประเภทของตัวอย่าง

4-Synchronization ของเซลล์ ในการสังเกตโครโมโซมควบแน่นในเซลล์เพาะเลี้ยงทั้งหมดในเวลาเดียวกันจำเป็นต้อง "ซิงโครไนซ์" ด้วยวิธีการทางเคมีที่หยุดการแบ่งเซลล์เมื่อโครโมโซมมีขนาดกะทัดรัดมากขึ้นจึงมองเห็นได้

5- การได้รับโครโมโซมจากเซลล์ หากต้องการดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์โครโมโซมจะต้องถูก "ดึง" ออกจากเซลล์ โดยปกติจะทำได้โดยการรักษาด้วยวิธีแก้ปัญหาที่ทำให้พวกมันแตกออกและสลายตัวโดยปล่อยโครโมโซมออกมา

6 การย้อมสี ตามที่ระบุไว้ข้างต้นโครโมโซมจะต้องได้รับการย้อมสีด้วยหนึ่งในเทคนิคที่มีอยู่มากมายเพื่อให้สามารถสังเกตได้ภายใต้กล้องจุลทรรศน์และทำการศึกษาที่เกี่ยวข้อง

7- การวิเคราะห์และการนับ สังเกตรายละเอียดของโครโมโซมเพื่อระบุตัวตน (ในกรณีที่รู้ล่วงหน้า) ลักษณะทางสัณฐานวิทยาเช่นขนาดตำแหน่งของเซนโทรเมียร์และรูปแบบแถบจำนวนโครโมโซมในตัวอย่างเป็นต้น

8 การจัดหมวดหมู่ หนึ่งในงานที่ยากลำบากที่สุดของนักเซลล์พันธุศาสตร์คือการจำแนกโครโมโซมโดยการเปรียบเทียบลักษณะของโครโมโซมเนื่องจากจำเป็นต้องพิจารณาว่าโครโมโซมใดเป็นโครโมโซม เนื่องจากในตัวอย่างมีเซลล์มากกว่าหนึ่งเซลล์จึงมีโครโมโซมเดียวกันมากกว่าหนึ่งคู่

ความผิดปกติของโครโมโซม

ก่อนที่จะอธิบายถึงการเปลี่ยนแปลงโครโมโซมต่างๆที่อาจมีอยู่และผลที่ตามมาต่อสุขภาพของมนุษย์จำเป็นต้องทำความคุ้นเคยกับลักษณะทางสัณฐานวิทยาทั่วไปของโครโมโซม

สัณฐานวิทยาของโครโมโซม

โครโมโซมเป็นโครงสร้างที่มีลักษณะเป็นเส้นตรงและมี "แขน" สองอันอันเล็ก (p) และอีกอันที่ใหญ่กว่า (q) ซึ่งแยกออกจากกันโดยบริเวณที่เรียกว่าเซนโตรเมียร์ซึ่งเป็นที่ตั้งเฉพาะของดีเอ็นเอที่มีส่วนร่วมในการยึดแกนหมุน ไมโทติกระหว่างการแบ่งเซลล์แบบไมโทติก

เซนโทรเมียร์สามารถอยู่ตรงกลางของแขนทั้งสอง p และ q ห่างจากจุดศูนย์กลางหรือใกล้กับปลายด้านใดด้านหนึ่ง (เมตริกศูนย์กลางกึ่งกลางหรืออะโครเซนตริก)

ที่ปลายแขนสั้นและยาวโครโมโซมจะมี "หมวก" ที่เรียกว่าเทโลเมียร์ซึ่งเป็นลำดับดีเอ็นเอที่อุดมไปด้วย TTAGGG ซ้ำและมีหน้าที่ในการปกป้องดีเอ็นเอและป้องกันการหลอมรวมระหว่างโครโมโซม

ในช่วงเริ่มต้นของวัฏจักรของเซลล์โครโมโซมจะถูกมองว่าเป็นโครมาทอยด์แต่ละตัว แต่เมื่อเซลล์จำลองขึ้นรูปแบบโครมาทิดสองพี่น้องที่มีสารพันธุกรรมเหมือนกัน มันคือคู่โครโมโซมเหล่านี้ที่เห็นในภาพถ่ายคาริโอไทป์

โครโมโซมมีระดับ "การบรรจุ" หรือ "การควบแน่น" ที่แตกต่างกัน: เฮเทอโรโครมาตินเป็นรูปแบบที่ควบแน่นมากที่สุดและไม่มีการใช้งานถอดความในขณะที่ยูโครมาตินสอดคล้องกับบริเวณที่หลวมกว่าและมีการถอดความ

ในคาริโอไทป์โครโมโซมแต่ละตัวจะมีความโดดเด่นดังที่ไฮไลต์ไว้ข้างต้นตามขนาดตำแหน่งของเซนโตรเมียร์และรูปแบบแถบเมื่อย้อมด้วยเทคนิคที่แตกต่างกัน

ความผิดปกติของโครโมโซม

จากมุมมองทางพยาธิวิทยาสามารถระบุการเปลี่ยนแปลงโครโมโซมที่เฉพาะเจาะจงซึ่งพบได้เป็นประจำในประชากรมนุษย์แม้ว่าสัตว์พืชและแมลงอื่น ๆ จะไม่ได้รับการยกเว้นจากสิ่งเหล่านี้

ความผิดปกติมักเกี่ยวข้องกับการลบและการทำซ้ำบริเวณของโครโมโซมหรือโครโมโซมทั้งหมด

ข้อบกพร่องเหล่านี้เรียกว่า aneuploidies ซึ่งเป็นการเปลี่ยนแปลงโครโมโซมที่เกี่ยวข้องกับการสูญเสียหรือได้รับโครโมโซมที่สมบูรณ์หรือบางส่วนของโครโมโซม การสูญเสียดังกล่าวเรียกว่า monosomies และผลกำไรนั้นเรียกว่า trisomies และจำนวนมากเหล่านี้เป็นอันตรายต่อทารกในครรภ์ที่กำลังพัฒนา

นอกจากนี้ยังอาจมีกรณีของการผกผันของโครโมโซมซึ่งลำดับของลำดับยีนเปลี่ยนไปเนื่องจากการหยุดพักพร้อมกันและการซ่อมแซมบางส่วนของโครโมโซมที่ผิดพลาด

การเปลี่ยนตำแหน่งยังเป็นการเปลี่ยนแปลงโครโมโซมที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของโครโมโซมส่วนใหญ่ที่มีการแลกเปลี่ยนระหว่างโครโมโซมที่ไม่เหมือนกันและอาจเป็นหรือไม่ซึ่งกันและกันก็ได้

นอกจากนี้ยังมีการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับความเสียหายโดยตรงต่อลำดับของยีนที่มีอยู่ใน DNA ของโครโมโซม และยังมีบางส่วนที่เกี่ยวข้องกับผลของ "เครื่องหมาย" จีโนมที่วัสดุที่สืบทอดมาจากพ่อแม่คนใดคนหนึ่งในสองคนนี้อาจนำมาด้วย

โรคของมนุษย์ที่ตรวจพบด้วยคาริโอไทป์

การวิเคราะห์ทางเซลล์วิทยาของการเปลี่ยนแปลงโครโมโซมก่อนและหลังคลอดเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการดูแลทางคลินิกที่ครอบคลุมของทารกโดยไม่คำนึงถึงเทคนิคที่ใช้เพื่อจุดประสงค์นี้

ดาวน์ซินโดรมเป็นหนึ่งในโรคที่ตรวจพบได้บ่อยที่สุดจากการศึกษาคาริโอไทป์และเกี่ยวข้องกับการไม่ทำงานของโครโมโซม 21 ซึ่งเป็นสาเหตุที่เรียกว่า trisomy 21

Karyotype ของมนุษย์ที่มี trisomy บนโครโมโซม 21 (ที่มา: โครงการจีโนมมนุษย์ของกระทรวงพลังงานแห่งสหรัฐอเมริกาผ่าน Wikimedia Commons)

มะเร็งบางชนิดตรวจพบโดยการศึกษาคาริโอไทป์เนื่องจากเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของโครโมโซมโดยเฉพาะการลบหรือการทำซ้ำยีนที่เกี่ยวข้องโดยตรงกับกระบวนการก่อมะเร็ง

ออทิสติกบางประเภทได้รับการวินิจฉัยจากการวิเคราะห์คาริโอไทป์และพบว่าการทำซ้ำโครโมโซม 15 มีส่วนเกี่ยวข้องกับเงื่อนไขเหล่านี้ในมนุษย์

ในบรรดาโรคอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการลบโครโมโซม 15 คือ Prader-Willi syndrome ซึ่งทำให้เกิดอาการต่างๆเช่นการขาดกล้ามเนื้อและการขาดระบบทางเดินหายใจในทารก

กลุ่มอาการ“ แมวร้องไห้” (จากภาษาฝรั่งเศส cri-du-chat) หมายถึงการสูญเสียแขนสั้นของโครโมโซม 5 และหนึ่งในวิธีการที่ตรงที่สุดสำหรับการวินิจฉัยคือการศึกษาทางเซลล์สืบพันธุ์ของคาริโอไทป์

การย้ายตำแหน่งของชิ้นส่วนระหว่างโครโมโซม 9 และ 11 เป็นการแสดงลักษณะของผู้ป่วยที่เป็นโรคสองขั้วโดยเฉพาะที่เกี่ยวข้องกับการหยุดชะงักของยีนบนโครโมโซม 11 ข้อบกพร่องอื่น ๆ บนโครโมโซมนี้ยังได้รับการสังเกตในข้อบกพร่องที่เกิดต่างๆ

จากการศึกษาของ Weh et al ในปี 1993 ผู้ป่วยมากกว่า 30% ที่เป็นมะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิด multiple myeloma และพลาสมาเซลล์มีคาริโอไทป์ที่มีโครโมโซมซึ่งมีโครงสร้างผิดปกติหรือผิดปกติโดยเฉพาะโครโมโซม 1, 11 และ 14 .

อ้างอิง

1. Alberts, B. , Dennis, B. , Hopkin, K. , Johnson, A. , Lewis, J. , Raff, M. , … Walter, P. (2004). ชีววิทยาของเซลล์ที่จำเป็น Abingdon: Garland Science, Taylor & Francis Group
2. Battaglia, E. (1994). นิวคลีโอโซมและนิวคลีโอไทป์: คำวิจารณ์เชิงศัพท์ แคริโอโลเกีย, 47 (3–4), 37–41
3. Elsheikh, M. , Wass, JAH, & Conway, G. (2001). autoimmune thyroid syndrome ในสตรีที่มีอาการ Turner's syndrome - ความสัมพันธ์กับ karyotype Clinical Endocrinology, 223–226.
4. เฟอร์กัส, K. (2018). สุขภาพดีมาก สืบค้นจาก www.verywellhealth.com/how-to-how-is-a-karyotype-test-done-1120402
5. Gardner, R. , & Amor, D. (2018). ความผิดปกติของโครโมโซมและการให้คำปรึกษาทางพันธุกรรมของการ์ดเนอร์และซัทเทอร์แลนด์ (ฉบับที่ 5) นิวยอร์ก: สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยออกซ์ฟอร์ด
6. Griffiths, A. , Wessler, S. , Lewontin, R. , Gelbart, W. , Suzuki, D. , & Miller, J. (2005) ความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม (ฉบับที่ 8) ฟรีแมน WH & Company
7. Rodden, T. (2010). พันธุศาสตร์สำหรับหุ่น (2nd ed.) อินเดียแนโพลิส: Wiley Publishing, Inc.
8. Schrock, E. , Manoir, S. , Veldman, T. , Schoell, B. , Wienberg, J. , Ning, Y. , … Ried, T. (1996) Karyotyping สเปกตรัมหลายสีของโครโมโซมมนุษย์ วิทยาศาสตร์, 273, 494-498.
9. Wang, T. , Maierhofer, C. , Speicher, MR, Lengauer, C. , Vogelstein, B. , Kinzler, KW, & Velculescu, VE (2002) karyotyping ดิจิทัล PNAS, 99 (25), 16156-16161