คราบ ZIEHL-NEELSEN: เหตุผลน้ำยาและเทคนิค - ชีววิทยา - 2026

Ziehl-Neelsenเทคนิคการระบายสีเพื่อแจ้งจุลินทรีย์กรดแอลกอฮอล์ทน (ARA) ชื่อของกระบวนการจุลชีววิทยานี้อ้างถึงผู้เขียน: นักแบคทีเรียวิทยา Franz Ziehl และนักพยาธิวิทยาฟรีดริชนีลเซน

เทคนิคนี้เป็นวิธีการย้อมสีที่แตกต่างกันประเภทหนึ่งซึ่งเกี่ยวข้องกับการใช้สีย้อมที่แตกต่างกันเพื่อสร้างความแตกต่างระหว่างโครงสร้างที่คุณต้องการสังเกตแยกความแตกต่างและระบุในภายหลัง คราบ Ziehl-Neelsen ใช้เพื่อระบุจุลินทรีย์บางประเภท

คราบ Ziehl-Neelsen

สิ่งมีชีวิตเหล่านี้บางส่วน ได้แก่ มัยโคแบคทีเรีย (เช่น Mycobacterium tuberculosis), nocardia (เช่น Nocardia sp.) และปรสิตเซลล์เดียว (เช่น Cryptosporidium parvum) แบคทีเรียหลายชนิดสามารถจำแนกได้โดยใช้เทคนิคทั่วไปที่เรียกว่า Gram stain

อย่างไรก็ตามกลุ่มแบคทีเรียบางกลุ่มต้องการวิธีการอื่นเพื่อให้สามารถระบุได้ เทคนิคเช่นคราบ Ziehl-Neelsen ต้องใช้สีย้อมร่วมกับความร้อนเพื่อแก้ไขอดีตที่ผนังเซลล์

จากนั้นก็มาถึงกระบวนการฟอกสีที่ให้ผลลัพธ์สองประการคือความต้านทานหรือความไวต่อการเปลี่ยนสีด้วยกรดและแอลกอฮอล์

รากฐาน

เหตุผลสำหรับเทคนิคการย้อมสีนี้ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของผนังเซลล์ของจุลินทรีย์เหล่านี้ ผนังประกอบด้วยกรดไขมันชนิดหนึ่งที่เรียกว่ากรดไมโคลิก สิ่งเหล่านี้มีลักษณะเฉพาะคือมีโซ่ยาวมาก

เมื่อกรดไขมันมีโครงสร้างที่ยาวมากจะสามารถกักเก็บสีย้อมได้ง่ายขึ้น แบคทีเรียบางสกุลยากที่จะย้อมด้วย Gram stain เนื่องจากมีกรดไมโคลิกในผนังเซลล์สูง

คราบ Ziehl-Neelsen ใช้คาร์โบลฟูซินสารประกอบฟีนอลิกซึ่งเป็นคราบพื้นฐาน สิ่งนี้มีความสามารถในการทำปฏิกิริยากับกรดไขมันของผนังเซลล์ซึ่งเป็นเนื้อข้าวเหนียวที่อุณหภูมิห้อง

การย้อมสีคาร์โบลฟูซินจะเพิ่มขึ้นเมื่อมีความร้อนเนื่องจากขี้ผึ้งละลายและโมเลกุลของสีย้อมจะเคลื่อนที่เข้าสู่ผนังเซลล์ได้เร็วขึ้น

กรดที่ใช้ในภายหลังทำหน้าที่เปลี่ยนสีเซลล์ที่ไม่ได้ย้อมสีเนื่องจากผนังของมันไม่เกี่ยวข้องกับสีย้อมมากพอ ดังนั้นความแรงของกรดฟอกขาวจึงสามารถกำจัดสีย้อมกรดได้ เซลล์ที่ต้านทานการเปลี่ยนสีนี้เรียกว่ากรด - ฟาส

สีรอง

หลังจากการเปลี่ยนสีของตัวอย่างแล้วจะมีการเปรียบเทียบกับสีย้อมอื่นที่เรียกว่าสีย้อมรอง โดยทั่วไปจะใช้เมทิลีนบลูหรือมาลาไคต์กรีน

สีย้อมรองจะเปื้อนวัสดุพื้นหลังและส่งผลให้เกิดความแตกต่างกับโครงสร้างที่ย้อมในขั้นตอนแรก เฉพาะเซลล์ที่เปลี่ยนสีเท่านั้นที่ดูดซับสีย้อมที่สอง (counterstain) และรับสีของมันในขณะที่เซลล์ที่เปลี่ยนสีจะยังคงมีสีแดงอยู่

ขั้นตอนนี้มักใช้ในการระบุ Mycobacterium tuberculosis และ Mycobacterium leprae ซึ่งเรียกว่า acid-fast bacilli

รีเอเจนต์

สีหลัก

ใช้ 0.3% carbol fuchsin (กรอง) สีย้อมนี้เตรียมจากส่วนผสมของแอลกอฮอล์: ฟีนอลในเอทานอล (90%) หรือเมทานอล (95%) และฟูซินพื้นฐาน 3 กรัมจะละลายในส่วนผสมนี้

น้ำยาฟอกสี

ในขั้นตอนนี้สามารถใช้สารละลายของกรดแอลกอฮอล์ 3% หรือกรดซัลฟิวริก 25%

สีย้อมรอง (สีย้อมเคาน์เตอร์)

สีย้อมที่ใช้ตัดกันตัวอย่างมากที่สุดมักจะเป็น 0.3% เมทิลีนบลู อย่างไรก็ตามยังสามารถใช้อื่น ๆ ได้เช่นมาลาไคต์กรีน 0.5%

เทคนิค

ขั้นตอนการย้อมสีกรดอย่างรวดเร็ว

เตรียมสเมียร์แบคทีเรีย

การเตรียมนี้ทำบนสไลด์ที่แห้งและสะอาดตามข้อควรระวังในการฆ่าเชื้อ

ละเลงแห้ง

ปล่อยให้สเมียร์แห้งที่อุณหภูมิห้อง

อุ่นตัวอย่าง

ตัวอย่างควรได้รับความร้อนโดยการใช้ไฟที่สไลด์ด้านล่าง การตรึงแอลกอฮอล์สามารถทำได้เมื่อไม่ได้เตรียมสเมียร์ด้วยเสมหะ (รับการบำบัดด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรท์เพื่อทำให้ขาวขึ้น) และหากยังไม่เปื้อนทันที

M. tuberculosis จะถูกกำจัดออกด้วยสารฟอกขาวและในระหว่างกระบวนการย้อมสี การตรึงด้วยความร้อนของเสมหะที่ไม่ผ่านการบำบัดจะไม่ฆ่าเชื้อวัณโรคในขณะที่การตรึงแอลกอฮอล์เป็นการฆ่าเชื้อแบคทีเรีย

ปิดรอยเปื้อน

คราบถูกปกคลุมด้วยสารละลายคาร์โบลฟูซิน (คราบพื้นฐานหลัก)

อุ่นคราบ

ขั้นตอนนี้ใช้เวลา 5 นาที คุณควรสังเกตเห็นวิวัฒนาการของไอน้ำ (ประมาณ 60 ° C) สิ่งสำคัญคืออย่าให้ความร้อนสูงเกินไปและหลีกเลี่ยงการเผาไหม้ตัวอย่าง

สำหรับการให้ความร้อนกับคราบนั้นควรใช้ความระมัดระวังเป็นอย่างยิ่งเมื่อให้ความร้อนกับคาร์โบลฟูซินโดยเฉพาะอย่างยิ่งถ้าการย้อมสีนั้นกระทำบนถาดหรือภาชนะอื่น ๆ ที่มีการรวบรวมสารเคมีที่ไวไฟสูงจากการย้อมสีก่อนหน้านี้

ควรใช้เปลวไฟเพียงเล็กน้อยใต้สไลด์โดยใช้ไม้กวาดที่มีไฟก่อนหน้านี้ชุบด้วยแอลกอฮอล์ที่เป็นกรดเมทานอลหรือเอทานอล 70% เพียงไม่กี่หยด หลีกเลี่ยงการใช้ไม้กวาดขนาดใหญ่แช่ในเอทานอลเนื่องจากอาจทำให้เกิดไฟไหม้ได้

ล้างคราบ

การล้างนี้ต้องทำด้วยน้ำสะอาด หากน้ำประปาไม่สะอาดให้ล้างรอยเปื้อนด้วยน้ำกรองหรือน้ำกลั่นโดยเฉพาะอย่างยิ่ง

ปิดรอยเปื้อนด้วยแอลกอฮอล์ที่เป็นกรด

แอลกอฮอล์กรดนี้ควรอยู่ที่ 3% การปกปิดจะดำเนินการเป็นเวลา 5 นาทีหรือจนกว่าสเมียร์จะเปลี่ยนสีอย่างเพียงพอนั่นคือสีชมพูอ่อน

ต้องคำนึงว่าแอลกอฮอล์ที่เป็นกรดเป็นสารไวไฟ ดังนั้นจึงต้องใช้ด้วยความระมัดระวังเป็นอย่างยิ่ง หลีกเลี่ยงการอยู่ใกล้แหล่งกำเนิดประกายไฟ

ล้างคราบ

ควรล้างด้วยน้ำกลั่นที่สะอาด

ปิดรอยเปื้อนด้วยรอยเปื้อน

อาจเป็นคราบมาลาไคท์สีเขียว (0.5%) หรือเมทิลีนบลู (0.3%) เป็นเวลา 1 ถึง 2 นาทีโดยใช้เวลานานขึ้นหากสเมียร์บาง ๆ

ล้างคราบ

ควรใช้น้ำสะอาด (กลั่น) อีกครั้ง

เพื่อระบายน้ำ

ควรทำความสะอาดด้านหลังของสไลด์และคราบวางบนตะแกรงระบายน้ำเพื่อให้อากาศแห้ง (อย่าใช้กระดาษซับมันในการทำให้แห้ง)

ตรวจสอบรอยเปื้อนภายใต้กล้องจุลทรรศน์

ต้องใช้น้ำมันวัตถุประสงค์และน้ำมันแช่ 100X สแกนรอยเปื้อนอย่างเป็นระบบและบันทึกข้อสังเกตที่เกี่ยวข้อง

ตีความผลลัพธ์

ในทางทฤษฎีจุลินทรีย์ที่เปื้อนสีแดงจัดว่าเป็นกรด - ผลบวกอย่างรวดเร็ว (AAR +)

ในทางตรงกันข้ามหากจุลินทรีย์เปื้อนสีน้ำเงินหรือสีเขียวขึ้นอยู่กับสีที่ใช้เป็นสีย้อมนับจะถือว่าเป็นกรด - ลบอย่างรวดเร็ว (AAR-)

อ้างอิง

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1st ed.). Jaypee Brothers สำนักพิมพ์ทางการแพทย์
2. บาว, อาร์. (2014). จุลชีววิทยากับโรคตามระบบร่างกาย (ฉบับที่ 4). Pearson Education, Inc.
3. เฮอริเทจ, J. , Evans, E. & Killington, A. (1996). จุลชีววิทยาเบื้องต้น (ฉบับที่ 1) สำนักพิมพ์มหาวิทยาลัยเคมบริดจ์
4. Morello, J. , Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). คู่มือการใช้ห้องปฏิบัติการและสมุดงานทางจุลชีววิทยา: การประยุกต์ใช้ในการดูแลผู้ป่วย (ฉบับที่ 11) การศึกษาของ McGraw-Hill
5. วสันตราชกุมารี, ร. (2550). ตำราจุลชีววิทยา (ฉบับที่ 1). BI สิ่งพิมพ์ PVT.