การย้อมสีสปอร์: เหตุผลเทคนิคและการใช้งาน - ชีววิทยา

การย้อมสีสปอร์เป็นวิธีการที่ใช้ในการระบายสีโครงสร้างความต้านทานซึ่งก่อตัวเป็นแบคทีเรียบางชนิดเมื่ออยู่ในสภาวะที่ไม่เอื้ออำนวย โครงสร้างเหล่านี้สอดคล้องกับรูปแบบการอยู่รอด

มีหลายสกุลที่สร้างสปอร์ อย่างไรก็ตามตัวหลักคือบาซิลลัสและคลอสตริเดียม สกุลเหล่านี้ถือว่ามีความเกี่ยวข้องมากขึ้นเนื่องจากมีสายพันธุ์ที่ทำให้เกิดโรคสำหรับมนุษย์

การย้อมสีสปอร์โดยวิธี Shaeffer - Fulton หรือ Wirtz-Conklin และ tambe (ผู้อัปโหลดต้นฉบับ) จาก Wikimedia Commons

บาซิลลัสแต่ละตัวสามารถก่อให้เกิดสปอร์ได้ ในช่วงเวลาของการย้อมสีเตรียมพบสปอร์ภายในบาซิลลัส (เอนโดสปอร์) หรือภายนอก (เอ็กโซสปอร์) ด้วยเทคนิคการย้อมสีแบบเดิมสำหรับแบคทีเรียเช่น Gram stain สปอร์จะยังคงไม่มีสี

ปัจจุบันมีวิธีการย้อมสีหลายวิธีที่สามารถเจาะโครงสร้างที่หนาของสปอร์เพื่อย้อมสีได้ วิธีการเหล่านี้มีความหลากหลายมาก ซึ่งรวมถึงเทคนิค Dorner, Möeller stain และ Shaeffer - Fulton methodology หรือที่เรียกว่า Wirtz-Conklin

จากเทคนิคทั้งหมดที่กล่าวมาวิธีการของ Shaeffer-Fulton เป็นวิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในห้องปฏิบัติการประจำ ได้รับการตั้งชื่อตามนักจุลชีววิทยาสองคนที่สร้างสีในปีพ. ศ. 2473: Alicia Shaeffer และ MacDonald Fulton อย่างไรก็ตามเทคนิคนี้บางครั้งเรียกว่า Wirtz-Conklin ตามนักแบคทีเรียสองคนในช่วงปี 1900

รากฐาน

สปอร์ไม่เปื้อนด้วยคราบธรรมดาเพราะมีผนังหนามาก องค์ประกอบที่ซับซ้อนของสปอร์ป้องกันการเข้ามาของสารสีส่วนใหญ่

หากศึกษาสปอร์จากภายนอกในชั้นต่อไปนี้จะสังเกตเห็น: อันดับแรกมี exosporium ซึ่งเป็นชั้นนอกที่บางที่สุดและชั้นนอกที่เกิดจากไกลโคโปรตีน

ถัดมาคือหนังกำพร้าซึ่งให้ความต้านทานต่ออุณหภูมิสูงตามด้วยเยื่อหุ้มสมองที่ประกอบด้วยเพปทิโดไกลแคน ต่อมาคือผนังของฐานที่ป้องกันโปรโตพลาสต์

สปอร์เป็นโครงสร้างที่ขาดน้ำซึ่งประกอบด้วยแคลเซียม 15% และกรดไดปิโคลินิก ดังนั้นเทคนิคการย้อมสีสปอร์ส่วนใหญ่จึงอาศัยการใช้ความร้อนเพื่อให้สีย้อมสามารถซึมผ่านโครงสร้างที่หนาได้

เมื่อเปื้อนสปอร์แล้วจะไม่สามารถขจัดสีย้อมได้ ในเทคนิค Shaeffer - Fulton มาลาไคต์กรีนจะเข้าสู่เซลล์พืชและเมื่อใช้ความร้อนจะแทรกซึมเข้าไปในเอนโดสปอร์เช่นเดียวกับเอ็กโซสปอร์

โดยการล้างด้วยน้ำสีย้อมจะถูกกำจัดออกจากเซลล์พืช สิ่งนี้เกิดขึ้นเนื่องจากสีย้อมสีเขียวมาลาไคต์มีพื้นฐานเล็กน้อยดังนั้นจึงผูกมัดกับเซลล์พืชได้ไม่ดี

แต่มันไม่สามารถออกจากสปอร์ได้และในที่สุดบาซิลลัสก็ถูกต่อต้านด้วยซาฟรานิน พื้นฐานนี้ใช้ได้กับเทคนิคที่เหลือซึ่งมีบางอย่างที่คล้ายกันเกิดขึ้น

เทคนิคการย้อมสีสปอร์

ในการดำเนินการย้อมสีสปอร์ต้องได้รับวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของสายพันธุ์ที่น่าสงสัยที่จะศึกษา

การเพาะเลี้ยงอยู่ภายใต้อุณหภูมิที่สูงมากเป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพื่อกระตุ้นให้จุลินทรีย์สร้างสปอร์ สำหรับสิ่งนี้สามารถวางวัฒนธรรมไว้ในเตาอบที่อุณหภูมิ 44 ° C หรือในตู้เย็น (8 ° C) เป็นเวลา 24 หรือ 48 ชั่วโมง

หากปล่อยทิ้งไว้นานเกินไปที่อุณหภูมิดังกล่าวจะสังเกตได้เฉพาะเอ็กโซสปอร์เนื่องจากเอนโดสปอร์ทั้งหมดจะออกจากบาซิลลัสไปแล้ว

เมื่อสิ้นสุดเวลาควรวางสารละลายทางสรีรวิทยาที่ปราศจากเชื้อสองสามหยดลงบนสไลด์ที่สะอาด จากนั้นส่วนหนึ่งของวัฒนธรรมจะถูกนำไปและทำการแพร่กระจายอย่างละเอียด

หลังจากนั้นปล่อยให้แห้งแก้ไขในความร้อนและย้อมด้วยหนึ่งในเทคนิคที่อธิบายด้านล่าง:

เทคนิค Dorner

1- เตรียมสารแขวนลอยเข้มข้นของจุลินทรีย์สปอร์ในน้ำกลั่นในหลอดทดลองและเติม Kinyoun carbol fuchsin ที่กรองแล้วในปริมาณที่เท่ากัน

2- วางท่อลงในอ่างที่มีน้ำเดือดประมาณ 5 ถึง 10 นาที

3- บนสไลด์ที่สะอาดให้ผสมสารแขวนลอยก่อนหน้าหยดหนึ่งหยดสารละลายนิโกรซีนในน้ำ 10% ต้มและกรอง

4- กระจายและแห้งอย่างรวดเร็วด้วยความร้อนอย่างอ่อนโยน

5- ตรวจสอบด้วยวัตถุประสงค์ 100X (การแช่)

สปอร์เปื้อนสีแดงและเซลล์แบคทีเรียแทบไม่มีสีกับพื้นหลังสีเทาเข้ม

เทคนิค Dorner ดัดแปลง

1- สารแขวนลอยของจุลินทรีย์สปอร์จะแพร่กระจายบนสไลด์และคงที่ในความร้อน

2- ตัวอย่างถูกปกคลุมด้วยแถบกระดาษกรองซึ่งมีการเติมคาร์โบลฟูซิน สีจะถูกให้ความร้อนเป็นเวลา 5 ถึง 7 นาทีด้วยเปลวไฟของเตา Bunsen จนกว่าจะมีการวิวัฒนาการของไอระเหย จากนั้นนำกระดาษออก

3- การเตรียมล้างด้วยน้ำแล้วซับให้แห้งด้วยกระดาษซับมัน

4- ปิดรอยเปื้อนด้วยฟิล์มบาง ๆ ของนิโกรซิน 10% โดยใช้สไลด์ที่สองเพื่อกระจายนิโกรซินหรือเข็ม

สีที่ถ่ายโดยสปอร์และแบคทีเรียนั้นเหมือนกับที่อธิบายไว้ในงานศิลปะก่อนหน้านี้

Shaeffer - เทคนิค Fulton หรือ Wirtz-Conklin

1- ทำการสเมียร์อย่างละเอียดด้วยการแขวนสปอร์จุลินทรีย์ไว้บนสไลด์แล้วแก้ไขด้วยความร้อน

2- ปิดฝาสไลด์ด้วยสารละลายสีเขียวมาลาไคต์ 5% (คุณสามารถวางกระดาษกรองบนสไลด์ได้)

3- ความร้อนเหนือเปลวไฟของเตา Bunsen เพื่อทำให้เกิดการปล่อยไอระเหยและขจัดเปลวไฟ ทำซ้ำการดำเนินการเป็นเวลา 6 ถึง 10 นาที หากสารละลายมาลาไคต์กรีนระเหยมากเกินไปในระหว่างขั้นตอนสามารถเพิ่มได้มากขึ้น

4- นำกระดาษกรองออก (หากติดตั้ง) แล้วล้างด้วยน้ำ

5- ปิดสไลด์ด้วยซาฟรานินน้ำ 0.5% เป็นเวลา 30 วินาที (เทคนิคบางรูปแบบใช้ซาฟรานินน้ำ 0.1% แล้วทิ้งไว้ 3 นาที)

ด้วยเทคนิคนี้สปอร์จะปรากฏเป็นสีเขียวและมีสีแดงของบาซิลลี

มีข้อเสียที่เอนโดสปอร์ของวัฒนธรรมที่อายุน้อยไม่สามารถย้อมสีได้ดีเนื่องจากมีลักษณะใสหรือไม่มีสี เพื่อหลีกเลี่ยงปัญหานี้ขอแนะนำให้ใช้วัฒนธรรมที่มีการบ่ม 48 ชั่วโมง

เทคนิคMöeller

1- ปิดรอยเปื้อนด้วยคลอโรฟอร์มเป็นเวลา 2 นาที

2- ทิ้งคลอโรฟอร์ม

3- ปิดทับด้วยกรดโครมิก 5% เป็นเวลา 5 นาที

4- ล้างด้วยน้ำกลั่น

5- แผ่นปิดด้วย carbol fuchsin-fenicada และสัมผัสกับเปลวไฟของเตา Bunsen จนกว่าจะมีการปล่อยไอระเหย จากนั้นจะถูกนำออกจากเปลวไฟสักครู่ การดำเนินการซ้ำจนกว่า 10 นาทีจะเสร็จสิ้น

6- ล้างด้วยน้ำ

7- ใช้เอทานอลที่เป็นกรด (แอลกอฮอล์ไฮโดรคลอริก) เพื่อเปลี่ยนสี ทิ้งไว้ 20 หรือ 30 วินาที

8- ล้างด้วยน้ำกลั่น

9- ตัดกันโดยปิดแผ่นด้วยเมทิลีนบลูเป็นเวลา 5 นาที

10- ล้างด้วยน้ำกลั่น

11- ปล่อยให้แห้งและนำตัวอย่างไปส่องกล้องจุลทรรศน์

สปอร์ปรากฏเป็นสีแดงและบาซิลลีสีน้ำเงิน สิ่งสำคัญคือไม่ควรหายใจเอาไอระเหยเข้าไปเพราะเป็นพิษและในระยะยาวอาจเป็นสารก่อมะเร็งได้

ดัดแปลงเทคนิคMöellerโดยไม่ใช้ความร้อน

ในปี 2007 Hayama และผู้ทำงานร่วมกันได้สร้างการปรับเปลี่ยนเทคนิคMöeller พวกเขากำจัดขั้นตอนในการให้ความร้อนแก่สีย้อมและแทนที่ด้วยการเติมสารลดแรงตึงผิว Tergitol 7 2 หยดสำหรับสารละลายคาร์โบลฟูซิน - คาร์โบลทุกๆ 10 มล. ได้ผลลัพธ์เดียวกัน

การประยุกต์ใช้งาน

การย้อมสีของสปอร์ให้ข้อมูลที่มีค่าและเป็นประโยชน์อย่างมากสำหรับการระบุเชื้อโรคเนื่องจากการมีอยู่รูปร่างตำแหน่งภายในบาซิลลัสและความสามารถในการทำให้เซลล์พืชผิดรูปหรือไม่เป็นข้อมูลที่สามารถชี้นำสายพันธุ์ได้ เกี่ยวข้องกับประเภทใดประเภทหนึ่ง

ในบริบทนี้เป็นเรื่องที่ควรค่าแก่การบอกว่าสปอร์สามารถเป็นทรงกลมหรือวงรีสามารถอยู่ตรงกลางหรือในตำแหน่งพาราเซนทรัลใต้น้ำหรือขั้ว

แผนภาพของรูปร่างและตำแหน่งของเอนโดสปอร์และเอกโซสปอร์

ตัวอย่าง

- Clostridium difficile สร้างสปอร์รูปไข่ในตำแหน่งขั้วที่ทำให้บาซิลลัสเสียรูป

- สปอร์ของ Clostridium tertium เป็นรูปไข่ไม่ทำให้บาซิลลัสเสียรูปทรงและอยู่ที่ระดับขั้ว

- เอนโดสปอร์ของ Clostridium tetani เป็นเทอร์มินัลและทำให้บาซิลลัสเสียรูปทำให้มีลักษณะเหมือนไม้ตีกลอง

- สปอร์ของ Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy และ C. septicum มีลักษณะกลมหรือรูปไข่ใต้เทอร์มินัลและทำให้บาซิลลัสเสียรูป

- เอนโดสปอร์ของคลอสตริเดียมซอร์เดลลีอยู่ในตำแหน่งกลางโดยมีการเปลี่ยนรูปเล็กน้อย

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา (ฉบับที่ 5) อาร์เจนตินาบรรณาธิการ Panamericana SA

อ้างอิง

Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. ข้อเสนอของเทคนิคที่เรียบง่ายในการย้อมสปอร์ของแบคทีเรียโดยไม่ใช้ความร้อน - การดัดแปลงวิธีของ Moeller ได้สำเร็จ Eur J Med Res.2007; 16 12 (8): 356-9.
ผู้ร่วมให้ข้อมูล Wikipedia คราบ Moeller Wikipedia สารานุกรมเสรี 3 พฤศจิกายน 2018, 03:28 UTC. ดูได้ที่: en.wikipedia.org
Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011) คู่มือปฏิบัติการเทคนิคจุลชีววิทยา. ภาควิชาวิทยาศาสตร์พื้นฐานสถาบันจุลชีววิทยา สถาบันโปลีเทคนิคแห่งชาติ.
“ เอนโดสปอร์” Wikipedia สารานุกรมเสรี 25 ก.พ. 2018 10:20 UTC 10 ม.ค. 2019, 02:42 น.: en.wikipedia.org
Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J และผู้ทำงานร่วมกัน (2549). บุคลากรด้านแรงงานของชุมชนอิสระของ Extremadura วาระเฉพาะเล่ม 4. บรรณาธิการ MAD. เซบียา - สเปน, pp 211-212
Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006) ผู้เชี่ยวชาญห้องปฏิบัติการช่างเทคนิคบริการสุขภาพกาลิเซีย (SERGAS) วาระเรื่องเฉพาะปริมาณ 2. กองบรรณาธิการ MAD. เซบียา - สเปน, หน้า 79-80
Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา (ฉบับที่ 5) อาร์เจนตินาบรรณาธิการ Panamericana SA
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 เอ็ด อาร์เจนตินา. กองบรรณาธิการ Panamericana SA

การย้อมสีสปอร์: เหตุผลเทคนิคและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2026