การทดสอบออกซิเดส: เหตุผลขั้นตอนและการใช้งาน - ชีววิทยา

การทดสอบออกซิเดสเป็นวิธีการวินิจฉัยที่แสดงให้เห็นว่ามีเอนไซม์คอมเพล็กซ์ที่เรียกว่าไซโตโครมออกซิเดส c ระบบนี้ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของไซโตโครมที่ลดลงเป็นออกซิไดซ์เนื่องจากมันจับออกซิเจนและจะทำหน้าที่เป็นตัวรับอิเล็กตรอนตัวสุดท้าย (H ⁺ ) ในห่วงโซ่ทางเดินหายใจ

คำว่าออกซิเดสเป็นวิธีชวเลขในการอ้างถึงเอนไซม์ไซโตโครมออกซิเดสหรือที่เรียกว่าอินโดฟีนอลออกซิเดส ในสมัยโบราณเชื่อกันว่าเอนไซม์ไซโตโครมออกซิเดสและอินโดฟีนอลออกซิเดสเป็นเอนไซม์สองชนิดที่แตกต่างกัน แต่ปัจจุบันเป็นที่รู้กันว่าเหมือนกัน

การทดสอบออกซิเดสบวกและลบ ที่มา: ไม่มีผู้เขียนที่อ่านได้โดยเครื่อง Alpha.prim ~ commonswiki สันนิษฐาน (ตามการร้องเรียนการละเมิดลิขสิทธิ์)

ในส่วนของพวกมันไซโตโครเมสเป็นฮีโมโปรตีนที่มีธาตุเหล็กและทำให้ระบบไซโตโครมออกซิเดสสมบูรณ์ Cytochromes อาจแตกต่างกันไปในแต่ละสายพันธุ์

ไซโตโครเมสมีหลายสายพันธุ์ (ไซโตโครเมส a1, a2, a3 และ 0) แบคทีเรียบางชนิดสามารถผลิตได้เพียงตัวเดียว แต่แบคทีเรียบางชนิดสามารถผลิตได้ครั้งละสองหรือสาม ในแง่นี้การปรากฏตัวของไซโตโครม a และ a3 เรียกว่าไซโตโครมออกซิเดส c นี่คือประเภทของไซโตโครมที่การทดสอบออกซิเดสตรวจพบ

สกุล Neisseria และ Pseudomonas มี cytochrome oxidase c สกุลเหล่านี้ให้การทดสอบออกซิเดสในเชิงบวกช่วยแยกความแตกต่างจากสกุล Acinetobacter และ Stenotrophomonas ตามลำดับ

นอกจากนี้ยังมีสกุลอื่น ๆ ที่ออกซิเดสบวก

รากฐาน

ลักษณะของระบบไซโตโครมออกซิเดส c

ระบบไซโตโครมออกซิเดส c ทำงานในลักษณะต่อไปนี้จุลินทรีย์ออกซิเดสบวกใช้ออกซิเจนเพื่อสร้างพลังงานผ่านการหายใจแบบแอโรบิค ระบบนี้ทำงานด้วยการขนส่งอิเล็กตรอนจากสารของผู้บริจาคเช่น NADH ⁺ไปยังสารตัวรับในกรณีนี้คือออกซิเจน

ส่งผลให้เกิดการผลิตพลังงาน (ATP) และน้ำหรือไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ขึ้นอยู่กับระบบไซโตโครมออกซิเดสที่จุลินทรีย์มีอยู่

นั่นคือเหตุผลที่แบคทีเรียบวกออกซิเดสส่วนใหญ่ยังเป็นคาตาเลสบวกซึ่งเป็นเงื่อนไขที่จำเป็นในการกำจัดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เกิดขึ้นเนื่องจากสารนี้เป็นพิษต่อแบคทีเรีย

ระบบไซโตโครมออกซิเดส c มีอยู่ในแบคทีเรียประเภทแอโรบิคบางชนิดไม่ใช้ออกซิเจนทางปัญญาบางชนิดมีจุลินทรีย์น้อยและไม่มีการใช้ออกซิเจนที่เข้มงวด สิ่งหลังนี้เป็นที่เข้าใจได้เนื่องจาก anaerobes ที่เข้มงวดไม่สามารถอาศัยอยู่ในที่ที่มีออกซิเจนได้ดังนั้นพวกมันจึงขาดระบบ cytochrome oxidase

หลักการทดสอบ

ในการทดสอบนี้ใช้สารที่ทำหน้าที่เป็นตัวรับอิเล็กตรอนเทียมแทนที่สารธรรมชาติภายในห่วงโซ่การขนส่งอิเล็กตรอน

โดยส่วนใหญ่จะใช้สีย้อมเช่น paraphenylenediamine และ indophenol ซึ่งทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นของตัวรับและผู้บริจาคอิเล็กตรอนเทียม

Paraphenylenediamine ถูกออกซิไดซ์โดยระบบ cytochrome oxidase c สีย้อมในรูปแบบรีดิวซ์ไม่มีสี แต่ในรูปแบบออกซิไดซ์จะมีสี

นี่คือการปรากฏตัวของระบบ cytochrome oxidase c; เนื่องจากปฏิกิริยาเชิงบวกจะทำให้เกิดสีลาเวนเดอร์หรือสีม่วงอมน้ำเงินขึ้นอยู่กับน้ำยาที่ใช้

ในทางกลับกันถ้าสารที่รับอิเล็กตรอนตัวสุดท้ายในห่วงโซ่ทางเดินหายใจแตกต่างจากออกซิเจนการทดสอบออกซิเดสจะเป็นลบ (ไม่มีการผลิตสี) เป็นกรณีของจุลินทรีย์ที่ไม่ใช้ออกซิเจน

ในทำนองเดียวกันถ้าไซโตโครมที่จุลินทรีย์ใช้แตกต่างจากไซโตโครมออกซิเดส c ก็จะให้ผลการทดสอบเชิงลบเช่นกัน

กระบวนการ

มีรีเอเจนต์และโปรโตคอลต่างๆสำหรับการทดสอบออกซิเดสทั้งหมดเพื่อวัตถุประสงค์เดียวกัน

รีเอเจนต์

น้ำยา Kovacs น้ำยา Gordon และ McLeod น้ำยา Nadi Carpenter น้ำยา Suhrland และ Morrison และการใช้แผ่นออกซิเดส

-Kovacs ออกซิเดสรีเอเจนต์

ประกอบด้วย tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%

น้ำยาของ Kovacs เตรียมโดยการละลาย 1 กรัมของสารดังกล่าวข้างต้นในน้ำกลั่น 50 มล. มันถูกให้ความร้อนอย่างละเอียดจนละลายหมด โอนไปยังขวดสีเหลืองอำพันที่มีความจุเพียงพอและสร้างปริมาตรเป็น 100 มล. ด้วยน้ำกลั่น รออย่างน้อย 15 นาทีก่อนใช้ เก็บในตู้เย็นที่ป้องกันแสง

มีชื่อว่า Kovacs oxidase reagent เพื่อแยกความแตกต่างจากรีเอเจนต์ Kovacs ที่ใช้ในการเปิดเผยการทดสอบอินโดล น้ำยานี้มีความไวต่อสารพิษน้อยที่สุด แต่มีราคาแพงกว่ารีเอเจนต์อื่น ๆ

ปฏิกิริยาเชิงบวกจะปรากฏให้เห็นด้วยน้ำยานี้เมื่อเปลี่ยนสีอาณานิคมเป็นลาเวนเดอร์ซึ่งจะเปลี่ยนเป็นสีม่วงเกือบดำอย่างรวดเร็ว ปฏิกิริยาเชิงลบจะเห็นได้ชัดเนื่องจากไม่มีการเปลี่ยนสีในอาณานิคมหรือมีสีชมพูเล็กน้อย สื่อสามารถทำให้มืดลงได้เช่นกัน แต่ไม่ได้หมายความว่าจะเกิดปฏิกิริยาเชิงบวก

ด้วยรีเอเจนต์นี้เวลาในการทำปฏิกิริยาจึงมีความสำคัญการเปลี่ยนสีที่เกิดขึ้นระหว่าง 5 ถึง 15 วินาทีถือเป็นปฏิกิริยาเชิงบวก

- น้ำยา Gordon และ McLeod

ประกอบด้วยไดเมทิล - พี - ฟีนิลเอมีนไดไฮโดรคลอไรด์หรือที่เรียกว่า N-dimethyl-p-phenylenediamine หรือ p-aminodimethylaniline monohydrochloride เตรียมตามที่อธิบายไว้สำหรับรีเอเจนต์ Kovacs ออกซิเดสทดแทนสารที่เกี่ยวข้อง

รีเอเจนต์นี้มีความเสถียรมากกว่ารีเอเจนต์ของ Kovacs oxidase เล็กน้อยแม้ว่ารีเอเจนต์ทั้งหมดที่มี p-phenylenediamine จะไม่เสถียร

ปฏิกิริยานี้เกิดขึ้นในภายหลังมันถูกตีความเป็นบวกโดยมีลักษณะเป็นสีน้ำเงินม่วงภายใน 10 ถึง 30 นาที

- น้ำยานาดี

ประกอบด้วยα-naphthol 1% ในเอทิลแอลกอฮอล์ (เอทานอล 95%) และ aminodimethylaniline 1% เตรียมส่วนผสมในส่วนที่เท่ากันและใช้เอทิลแอลกอฮอล์สัมบูรณ์เป็นตัวเจือจางจนได้ปริมาณที่เพียงพอสำหรับ 100 มล.

-Carpenter, Suhrland และ Morrison reagent

ประกอบด้วย 1% p-aminodimethylalanine oxalate เตรียมในลักษณะเดียวกับที่อธิบายไว้สำหรับน้ำยา Kovacs oxidase เปลี่ยนสำหรับสารที่เกี่ยวข้อง

เมื่อเตรียมสารละลายแล้วให้เตรียมแถบทดสอบดังนี้: แถบกระดาษกรอง Whatman No. 1 6-8 ซม. ชุบด้วยน้ำยาไดเมทิล - พี - ฟีนิลเอมีนออกซาเลต 1%

อนุญาตให้แห้งโดยไม่ต้องสัมผัสกับโลหะเก็บในขวดที่มีฝาปิดด้วยสารดูดความชื้นและเก็บในตู้เย็น แถบเหล่านี้มีความเสถียรนานถึง 6 เดือน

เป็นรีเอเจนต์ที่เสถียรที่สุดในบรรดาน้ำยาที่กล่าวถึงและสามารถใช้งานได้นานถึง 6 เดือนในการแก้ปัญหา ข้อดีอีกประการหนึ่งก็คือมันจะไม่ทำให้สีกลางรอบ ๆ อาณานิคมถ้าใช้บนจานโดยตรง

การปรากฏตัวของสีแดงถูกตีความว่าเป็นการทดสอบในเชิงบวก

-Oxidase แผ่น

เป็นแผ่นดิสก์ทางการค้าที่ชุบด้วยรีเอเจนต์สำหรับการทดสอบออกซิเดส มีแบรนด์เชิงพาณิชย์มากมายในตลาด

การใช้งานค่อนข้างใช้งานได้จริงเนื่องจากไม่จำเป็นต้องเตรียมน้ำยาใหม่ซึ่งจะอำนวยความสะดวกในการทำงาน ผลลัพธ์ที่ได้นั้นเชื่อถือได้ตราบเท่าที่แผ่นดิสก์ได้รับการเก็บรักษาไว้อย่างเหมาะสม

โปรโตคอล

วิธีแผ่นตรงวิธีทางอ้อมบนกระดาษและการใช้แผ่นที่ชุบด้วยรีเอเจนต์ออกซิเดส

- วิธีการคณะกรรมการโดยตรง

2 หรือ 3 หยดของรีเอเจนต์ที่กล่าวมาข้างต้นจะถูกเติมลงไปเพื่อจุดประสงค์นี้โดยตรงบนโคโลนีที่มีอยู่ในจานเพาะเชื้อที่ไม่มีน้ำตาลกลูโคส

การตีความการเปลี่ยนแปลงหรือไม่ของสีของอาณานิคมไม่ใช่ของตัวกลาง เวลาในการทำปฏิกิริยาที่ถูกต้องขึ้นอยู่กับน้ำยาที่ใช้

- วิธีการทางอ้อมบนกระดาษ

ตัดกระดาษกรอง (Whatman No. 1) ขนาด 6 ซม. ²แล้ววางไว้ในจานเลี้ยงเชื้อที่ว่างเปล่า

เติมน้ำยา Kovacs oxidase 2 หรือ 3 หยดลงในกระดาษนำส่วนหนึ่งของอาณานิคมที่จะศึกษาด้วยด้ามทองคำขาวหรือไม้จิ้มฟันไม้แล้วเกลี่ยเป็นเส้นตรงบนกระดาษชุบน้ำยา ตีความภายใน 5 ถึง 10 วินาที

ด้วยแถบที่เตรียมด้วยน้ำยา Carpenter, Suhrland และ Morrison อาณานิคมจะกระจายอยู่บนแถบแห้ง แถบเดียวใช้ในการทดสอบหลายสายพันธุ์ ตีความใน 10 วินาที

- ดิสก์ (ม

ชุบแผ่นดิสก์ทางการค้าอย่างละเอียดด้วยน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อและทาชั้นบนอาณานิคมที่ต้องการศึกษา ขอแนะนำให้ใช้จานที่อุณหภูมิ 35 ° C หากใช้จานที่อุณหภูมิห้องหรือจานแช่เย็นปฏิกิริยาจะช้าลงเล็กน้อย ตีความการเปลี่ยนสีระหว่าง 10 ถึง 20 วินาที

สามารถใช้โคโลนีที่มีอยู่ในเลือดหรือวุ้นช็อกโกแลตได้

-Disks (วิธีทางอ้อม)

ทำให้แผ่นดิสก์เปียกตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ วางไว้ในจานเพาะเชื้อที่ว่างเปล่า ใช้โคโลนีในปริมาณที่เพียงพอเพื่อศึกษาด้วยด้ามแพลตตินั่มหรือไม้จิ้มฟันไม้แล้ววางลงบนดิสก์ ตีความการเปลี่ยนสีระหว่าง 10 ถึง 20 วินาที

ใช้

สกุล Neisseria และ Acinetobacter บางครั้งมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่คล้ายคลึงกันมากเนื่องจากแม้ว่าสกุล Acinetobacter จะมีลักษณะเป็นแท่งแกรมลบ แต่บางครั้งก็สามารถอยู่ในรูปแบบโคคอยด์และกระจายเป็นคู่ ๆ เพื่อจำลองสกุล Neisseria

ในกรณีนี้การทดสอบออกซิเดสมีประโยชน์จริงๆ สกุล Neisseria เป็นบวกและ Acinetobacter เป็นลบ

อย่างไรก็ตามสกุล Moraxella มีความคล้ายคลึงกับสกุล Neisseria มากและทั้งคู่ให้ปฏิกิริยาเชิงบวก นี่คือเหตุผลที่ต้องทำการทดสอบการหมักคาร์โบไฮเดรตเพื่อระบุตัวตนที่ชัดเจนเสมอ

ในทางกลับกันการทดสอบออกซิเดสมีประโยชน์ในการแยกความแตกต่างของแบคทีเรียที่อยู่ในตระกูล Enterobacteriaceae (ออกซิเดสลบทั้งหมด) จากถังหมักอื่น ๆ เช่น Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oxidase positive)

สกุล Vibrio และ Helicobacter ยังเป็นออกซิเดสบวก

ระบบประกันคุณภาพ

ใช้สายพันธุ์ Escherichia coli ที่รู้จักกันดีเป็นตัวควบคุมเชิงลบและสายพันธุ์ของ Pseudomonas aeruginosa เป็นการควบคุมเชิงบวก

ข้อ จำกัด

- ต้องใช้รีเอเจนต์ที่เตรียมสดใหม่อายุการเก็บรักษาในสารละลายที่อุณหภูมิห้องจะสั้นเนื่องจากไม่เสถียรมาก แช่เย็นสามารถอยู่ได้ระหว่าง 5 วันถึง 2 สัปดาห์

- น้ำยาไม่มีสีหากเปลี่ยนสีต้องทิ้ง แผ่นที่เสียหายจะปรากฏขึ้นเนื่องจากมืดลงเมื่อเวลาผ่านไป

- ปฏิกิริยาบวกกับรีเอเจนต์ Kovacs ออกซิเดสระหว่าง 15-60 วินาทีถือเป็นปฏิกิริยาที่ล่าช้าและหลังจาก 60 วินาทีควรถือว่าเป็นลบ

-Haemophylus influenzae ให้ปฏิกิริยาออกซิเดสเชิงลบหากใช้รีเอเจนต์ใด ๆ ที่มีไดเมทิล - พี - ฟีนิลเลเนดีเอมีน แต่เป็นบวกถ้าใช้รีเอเจนต์ Kovacs oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine)

- ขนาดกลางที่มีกลูโคสรบกวนการทดสอบให้ผลลบเท็จ

- สายพันธุ์ไอกรน Bordetella สามารถให้ปฏิกิริยาบวกที่ผิดพลาดได้หากมาจากแผ่นวุ้นในเลือดที่มีความเข้มข้นสูง

- การใช้มือจับโลหะ (เหล็ก) ทำให้เกิดปฏิกิริยาบวกที่ผิดพลาด

คำแนะนำ

- เนื่องจากรีเอเจนต์ไม่เสถียรมากและมีแนวโน้มที่จะออกซิไดซ์ได้เองขอแนะนำให้แช่แข็งส่วนแบ่ง 1 ถึง 2 มล. และนำออกตามความจำเป็น

- อีกวิธีหนึ่งในการชะลอการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชั่นอัตโนมัติของรีเอเจนต์คือการเติมกรดแอสคอร์บิก 0.1% เมื่อเตรียมรีเอเจนต์

- เนื่องจากรีเอเจนต์ไม่เสถียรขอแนะนำให้มีการควบคุมคุณภาพรายสัปดาห์

- ไม่ควรใช้รีเอเจนต์ที่ไม่ผ่านการทดสอบการควบคุมคุณภาพ

อ้างอิง

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา 5th ed. กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
"การทดสอบออกซิเดส" Wikipedia สารานุกรมเสรี 15 ม.ค. 2018, 10:32 UTC. 3 เม.ย. 2562, 14:03 น
องค์การอนามัยโลก. คู่มือห้องปฏิบัติการสำหรับการระบุและทดสอบความไวต่อการต้านจุลชีพของแบคทีเรียก่อโรคที่มีความสำคัญทางสาธารณสุขในโลกกำลังพัฒนา 2547. มีจำหน่ายที่: who.int/drugresistance/infosharing
แถบรีเอเจนต์สำหรับการวินิจฉัยกิจกรรมออกซิเดสในแบคทีเรีย Rev Cubana Med Trop. 2000 52 (2): 150-151.

การทดสอบออกซิเดส: เหตุผลขั้นตอนและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2025