- รากฐาน
- เทคนิคประจำสำหรับการทดสอบ Catalase
- - วิธีการเลื่อน
- วัสดุ
- กระบวนการ
- การตีความ
- - วิธีการโดยตรงในวัฒนธรรมบริสุทธิ์
- - วิธีการใส่ท่อฝอยหรือ Fung และ Petrishko
- -Taylor และวิธี Achanzar สำหรับการทดสอบ catalase ที่ให้ข้อสงสัย
- การทดสอบ Catalase สำหรับ Mycobacterium species
- -Materials
- -Preparation
- ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7
- 10% ทวีคูณ 80
- น้ำยาขั้นสุดท้าย
- -กระบวนการ
- ใช้
- ระบบประกันคุณภาพ
- ข้อ จำกัด
- อ้างอิง
การทดสอบ catalaseเป็นวิธีการที่ใช้ในห้องปฏิบัติการแบคทีเรียเพื่อแสดงให้เห็นว่ามีเอนไซม์คาตาเลสอยู่ในแบคทีเรียที่มีอยู่ ร่วมกับ Gram stain เป็นการทดสอบหลักที่ควรดำเนินการกับจุลินทรีย์ที่แยกได้ใหม่ การทดสอบเหล่านี้แนะนำนักจุลชีววิทยาเกี่ยวกับขั้นตอนในการปฏิบัติตามเพื่อระบุตัวตนที่ชัดเจนของจุลินทรีย์ที่เป็นปัญหา
โดยทั่วไปแบคทีเรียที่มีไซโตโครมมีเอนไซม์คาตาเลสซึ่งหมายความว่าแบคทีเรียแอโรบิกและแบคทีเรียที่ไม่ใช้ออกซิเจนควรมีไว้ในครอบครอง อย่างไรก็ตามมีข้อยกเว้นเช่น Streptococcus ซึ่งแม้จะเป็นจุลินทรีย์แบบไม่ใช้ออกซิเจนแบบ facultative แต่ก็ไม่มีเอนไซม์ catalase
ทำการทดสอบ Catalase โดยแสดงปฏิกิริยาเชิงบวก ที่มา: ไม่มีผู้เขียนที่อ่านได้โดยเครื่อง Nase สันนิษฐาน (ตามการร้องเรียนการละเมิดลิขสิทธิ์)
นี่คือเหตุผลที่การทดสอบ catalase ถูกใช้เพื่อแยกความแตกต่างของตระกูล Staphylococaceae และ Micrococaceae (catalase positive) จากตระกูล Streptococaceae (catalase negative)
ในทำนองเดียวกันสกุล Bacillus (catalase positive) นั้นแตกต่างจากสกุล Clostridium (catalase negative) และอื่น ๆ
รากฐาน
Catalase เป็นเอนไซม์ที่จัดอยู่ในประเภทไฮโดรเพอรอกซิเดสซึ่งหมายความว่าพวกมันใช้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H 2 O 2 ) เป็นสารตั้งต้น
นอกจากนี้ยังถือว่าเป็น oxidoreductase เนื่องจากในปฏิกิริยาที่มีส่วนร่วมมีองค์ประกอบที่ทำหน้าที่เป็นผู้บริจาคอิเล็กตรอน (สารรีดิวซ์) และอีกตัวหนึ่งเป็นตัวรับอิเล็กตรอน (สารออกซิไดซ์)
คาตาเลสเป็นโปรตีนที่มีกลุ่มโปรเซอริกที่มีอะตอมเหล็กไตรวาเลนต์ 4 อะตอม (Fe +++ ) ดังนั้นจึงเป็นโฮโมโปรตีน เฟอร์ริกไอออนยังคงถูกออกซิไดซ์ในระหว่างปฏิกิริยา
กล่าวได้ว่าคาตาเลสเป็นเอนไซม์ล้างพิษเนื่องจากหน้าที่ของมันคือกำจัดสารที่เกิดขึ้นระหว่างการเผาผลาญของแบคทีเรียที่เป็นพิษต่อแบคทีเรีย ในบรรดาสารเหล่านี้ ได้แก่ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เกิดจากการสลายน้ำตาลแบบแอโรบิค กระบวนการนี้เกิดขึ้นดังนี้:
ซูเปอร์ออกไซด์ไอออน (O 2 - ) (อนุมูลอิสระ) ถูกสร้างขึ้นเป็นผลิตภัณฑ์สุดท้ายของการดูดซึมกลูโคสโดยวิธีแอโรบิค สิ่งนี้เป็นพิษและถูกกำจัดโดยเอนไซม์ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมูเทสที่เปลี่ยนเป็นก๊าซออกซิเจนและไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ยังเป็นพิษต่อแบคทีเรียและต้องกำจัดออก เอนไซม์คาตาเลสสลายไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ลงในน้ำและออกซิเจน
คาตาเลสสามารถทำหน้าที่บนพื้นผิวอื่นที่ไม่ใช่ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เช่นแอลกอฮอล์อัลดีไฮด์กรดอะโรมาติกเอมีนและฟีนอล อย่างไรก็ตามคาตาเลสสามารถใช้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์เพื่อออกซิไดซ์สารประกอบที่เป็นพิษอื่น ๆ เช่นเมธิลและเอทิลแอลกอฮอล์
ในทำนองเดียวกัน catalase มีอยู่ในเซลล์ phagocytic ปกป้องมันจากพิษของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์
เทคนิคประจำสำหรับการทดสอบ Catalase
- วิธีการเลื่อน
วัสดุ
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% (10 เล่ม)
สไลด์กล้องจุลทรรศน์
ที่จับพลาสติกแบบใช้แล้วทิ้งหรือไม้จิ้มฟันไม้
กระบวนการ
ศึกษาอาณานิคมให้เพียงพอโดยไม่ต้องสัมผัสกับวุ้นที่มันมา อาณานิคมต้องสดนั่นคือจากวัฒนธรรม 18 ถึง 24 ชั่วโมง
วางโคโลนีลงบนสไลด์แห้งแล้วเติมไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% หยดลงไป (สามารถใช้30% H 2 O 2ได้ด้วย) สังเกตทันทีว่ามีการปล่อยฟองหรือไม่
การตีความ
ปฏิกิริยาเชิงบวก: วิวัฒนาการของก๊าซหลักฐานจากการก่อตัวของฟองอากาศ (ฟองสบู่ที่รุนแรง)
ปฏิกิริยาเชิงลบ: ไม่ก่อตัวเป็นฟอง
- วิธีการโดยตรงในวัฒนธรรมบริสุทธิ์
วาง3% H 2 O 2 1 มล. บนจานบริสุทธิ์หรือเพาะเลี้ยงลิ่มที่ไม่มีเลือด (ควรเป็นวุ้นที่มีสารอาหาร) สังเกตว่ามีฟองเกิดขึ้นทันทีหรือไม่ 30% H 2 O 2ยังสามารถใช้
มันถูกตีความเช่นเดียวกับเมธอด porta object
- วิธีการใส่ท่อฝอยหรือ Fung และ Petrishko
เติมท่อแคปิลลารีขนาด 67 มม. ถึงความสูง 20 มม. ด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% โดยแคปิลลารี
แตะอาณานิคมแยกที่จะศึกษากับเส้นเลือดฝอยที่เต็มไปด้วย 3% H 2 O 2 สังเกตว่าเส้นเลือดฝอยเต็มไปด้วยฟองอากาศในเวลาประมาณ 10 วินาทีหรือไม่ วิธีนี้ช่วยให้สามารถหาค่ากึ่งปริมาณของปฏิกิริยาในกากบาท:
หากไม่มีไม้กางเขนจะไม่มีฟองอากาศ (ปฏิกิริยาเชิงลบ)
+ ---- ไม่กี่ฟอง (ปฏิกิริยาที่อ่อนแอหรือล่าช้า)
++ --– ฟองอากาศมากมาย (ปฏิกิริยาปานกลาง)
+++ - ฟองสบู่ไปถึงฝั่งตรงข้าม (ปฏิกิริยาที่รุนแรง)
-Taylor และวิธี Achanzar สำหรับการทดสอบ catalase ที่ให้ข้อสงสัย
วางอาณานิคมที่แยกไว้บนสไลด์ที่แห้งและสะอาดจากนั้นวางหยด0.5% H 2 O 2แล้วปิดด้วยผ้าคลุม สังเกตว่ามีฟองอากาศติดอยู่หรือไม่.
การตีความ: การปรากฏตัวของฟองอากาศบ่งบอกถึงปฏิกิริยาเชิงบวก ไม่มีฟองอากาศถูกตีความว่าเป็นปฏิกิริยาเชิงลบ
การทดสอบ Catalase สำหรับ Mycobacterium species
เทคนิคนี้ต้องทำโดยการควบคุม pH และอุณหภูมิ ต้องดำเนินการภายใต้เครื่องดูดควันแบบลามินาร์เนื่องจากการจัดการกับ Mycobacterium สายพันธุ์ที่แตกต่างกันเป็นอันตราย
-Materials
ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 30% หรือ 110 เล่ม (superoxal)
ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7
10% ทวีคูณ 80
Mycobacterium wedge culture เป็นเวลา 3 ถึง 4 สัปดาห์
-Preparation
ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 7
ในการชั่งน้ำหนัก:
โมโนโปแตสเซียมฟอสเฟตปราศจากน้ำ1.361 กรัม (KH 2 PO 4 )
1.420 กรัมของไดโซเดียม (Na2HPO3) ฟอสเฟต
ละลายเกลือทั้งสองในน้ำกลั่นที่ปราศจากเชื้อเล็กน้อยและเติมน้ำได้ถึง 1,000 มล.
10% ทวีคูณ 80
ทำการเจือจาง 1:10 ถึง Tween 80 ที่มีความเข้มข้นในเชิงพาณิชย์เพื่อดำเนินการดังต่อไปนี้:
นำ Tween 80 1 มล. มาใส่ในน้ำกลั่นเล็กน้อยละลายน้ำแล้วเติมปริมาตรด้วยน้ำสูงสุด 10 มล.
น้ำยาขั้นสุดท้าย
ผสมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ปริมาณ 10% ทวีน 80 (ส่วนเท่า ๆ กัน) กำหนดในห้องปฏิบัติการว่าต้องการเตรียมเท่าไร
-กระบวนการ
ใส่ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 5 มล. ลงในหลอดทดลองแบบฝาเกลียว (Bakelite) ที่ปราศจากเชื้อ
ด้วยการฉีดวัคซีนให้ใช้อาณานิคมของการเจริญเติบโตของ Mycobacterium ที่เพาะเมล็ดในรูปลิ่มและละลายในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต
ปิดฝาท่อโดยไม่ต้องขันด้ายให้แน่นเกินไป วางในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 68 ° C เป็นเวลา 20 ถึง 30 นาที นำออกมาปล่อยให้เย็นถึง 22-25 ° C
ตวง 0.5 มล. ของรีเอเจนต์สุดท้าย (ผสม) แล้วเติมลงในหลอดด้วยสารละลายเย็น สังเกตการก่อตัวหรือไม่ของฟองอากาศ
มันถูกตีความเช่นเดียวกับเทคนิคก่อนหน้านี้
ใช้
เมื่อได้รับการเจริญเติบโตของอาณานิคมในอาหารเลี้ยงเชื้อควรทำการทดสอบแกรมสเตนและคาตาเลสกับโคโลนีที่ได้รับ สิ่งนี้จะแนะนำนักจุลชีววิทยาเกี่ยวกับขั้นตอนในการปฏิบัติตามเพื่อระบุตัวตนที่ชัดเจน
ที่มา: จัดทำโดยผู้เขียน MSc. Marielsa Gil
ระบบประกันคุณภาพ
ในการประเมินประสิทธิภาพที่ดีของรีเอเจนต์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ให้ใช้สายพันธุ์ควบคุมที่เพาะเลี้ยงสดเช่น Staphylococcus aureus เป็นตัวควบคุมเชิงบวกและสายพันธุ์ Streptococcus sp เป็นตัวควบคุมเชิงลบ
อีกทางเลือกหนึ่งที่ทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมเชิงบวกคือการหยดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ลงบนวุ้นในเลือดเม็ดเลือดแดงมีคาตาเลสดังนั้นจะมีฟองหากน้ำยาอยู่ในสภาพดี
วุ้นช็อคโกแลตสามารถใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบได้ที่นี่เม็ดเลือดแดงจะถูกสลายไปแล้วและการทดสอบเป็นลบ
ข้อ จำกัด
- อย่าใช้วัฒนธรรมเก่าในการทดสอบเพราะอาจทำให้เกิดผลลบที่ผิดพลาดได้
- หลีกเลี่ยงการรับโคโลนีจากเชื้อจากวุ้นในเลือดหากคุณระมัดระวังไม่ให้สัมผัสวุ้น ขั้นตอนนี้อาจนำไปสู่ผลบวกปลอมเนื่องจากเซลล์เม็ดเลือดแดงมี catalase
- หากคุณใช้โคโลนีด้วยที่จับแพลตตินั่มอย่ากลับลำดับของโพรซีเดอร์เพราะอาจทำให้เกิดผลบวกปลอมได้ เนื่องจากแพลตตินั่มสามารถทำปฏิกิริยากับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ทำให้เกิดฟองได้
- อย่าใช้รีเอเจนต์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์หากเก่ามากเนื่องจากรีเอเจนต์ไม่เสถียรมากและมีแนวโน้มที่จะสลายไปตามกาลเวลา
- เก็บน้ำยาไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ป้องกันแสงและแช่เย็นเพื่อป้องกันความเสียหาย
- ดำเนินการควบคุมคุณภาพของรีเอเจนต์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ทุกครั้งที่ใช้
- คำนึงว่าถ้าใช้30% H 2 O 2ปฏิกิริยาจะรุนแรงกว่าปฏิกิริยาที่ทำด้วย3% H 2 O 2
อ้างอิง
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยา 5th ed. กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). การวินิจฉัยทางจุลชีววิทยาของ Bailey & Scott 12 เอ็ด กองบรรณาธิการ Panamericana SA Argentina
- Mac Faddin J. (2003). การทดสอบทางชีวเคมีเพื่อระบุแบคทีเรียที่มีความสำคัญทางคลินิก 3rd ed. กองบรรณาธิการ Panamericana บัวโนสไอเรส. อาร์เจนตินา.
- BD Laboratories น้ำยาคาตาเลส - โกทาริโอ มีจำหน่ายที่: http://winklerltda.cl
- Vadequímica Laboratories เปอร์ออกไซด์. ความเท่าเทียมกันระหว่างปริมาณและเปอร์เซ็นต์ มีจำหน่ายที่: vadequimica.com