- ลักษณะของ Proteinase K
- กิจกรรมของเอนไซม์
- การประยุกต์ใช้งาน
- ข้อดีของโปรตีนเค
- โปรตีนที่ทนต่อ Proteinase K
- อ้างอิง
โปร Kเป็นเอนไซม์ที่อยู่ในกลุ่มของโปรตีเอสซีรีนเช่นนั้นจะมีในช่วงกลางของการใช้งานแบบเร่งปฏิกิริยากรดอะมิโนซีรีนและมีฟังก์ชั่นของการทำลายพันธบัตรเปปไทด์โดยการย่อยสลาย ในทางกลับกันเอนไซม์นี้อยู่ในตระกูลโปรตีน subtilisin (peptidase S8)
Proteinase K มีน้ำหนักโมเลกุล (MW) 28,900 ดาลตันและถูกแยกเป็นครั้งแรกในปีพ. ศ. 2517 ในสารสกัดจากเชื้อราอัลบั้ม Engyodontium ซึ่งก่อนหน้านี้รู้จักกันในชื่ออัลบั้ม Tritirachium Limber
โครงสร้างโมเลกุลของ Proteinase K. ที่มา: Lykchiniadis
มีความสามารถในการย่อยโปรตีนสูงแสดงให้เห็นจากความสามารถในการย่อยสลายเคราตินที่มีอยู่ในเส้นผม คำว่า keratin ในภาษาอังกฤษสะกดว่า "keratin" จึงถูกเรียกว่า "proteinase K"
เนื่องจากมีพลังสูงในการแยกโปรตีนพื้นเมืองเอนไซม์นี้จึงมีประโยชน์ในเทคนิคอณูชีววิทยาต่างๆ ส่วนใหญ่ใช้เพื่อแยกและเตรียมกรดนิวคลีอิกที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง (MW)
Proteinase K ทำงานโดยการปล่อย DNA นิวเคลียร์ในขณะที่ทำลายโปรตีนและยับยั้ง RNases และ DNases นั่นคือกำจัดนิวคลีเอสในการเตรียม DNA และ RNA
ในทางกลับกันมีการเห็นว่าโปรตีนเอสเคสามารถไฮโดรไลซ์โปรตีนพื้นเมืองบางชนิดซึ่งทำให้เกิดความสนใจของนักวิจัยเพื่อใช้ในการศึกษาโปรตีนพรีออน (PrPC)
อย่างไรก็ตามแม้จะมีความสามารถในการย่อยโปรตีนสูง แต่ก็มีโปรตีนที่ทนทานต่อการทำงานของโปรตีนเอสเคในบรรดาโปรตีนที่ผิดปกติบางชนิดเรียกว่าพรีออน (PrPSc) ซึ่งเกี่ยวข้องกับเอนซีฟาโลพาธีที่แพร่กระจายได้
ลักษณะของ Proteinase K
Proteinase K มีโครงสร้างระดับตติยภูมิซึ่งประกอบด้วยสามชั้นโดยมีแผ่นเจ็ดห่วงเชื่อมระหว่างเกลียวสองชั้น เนื่องจากเป็นของตระกูลเปปไทเดส S8 จึงมีลักษณะพิเศษคือมีกลุ่มตัวเร่งปฏิกิริยาในไซต์ที่ใช้งานอยู่ซึ่งมีลำดับตามลำดับคือ (Asp, His และ Ser) ซึ่งแตกต่างจากตระกูลเปปไทเดสอื่น ๆ
เอนไซม์จากกลุ่มซีรีนโปรตีเอสนี้มีลักษณะการไฮโดรไลซิงพันธะเปปไทด์ใกล้กับกลุ่มคาร์บอกซิลิกของกรดอะมิโนอะลิฟาติกและอะโรมาติก
ในทางกลับกันมันสามารถออกฤทธิ์ต่อหน้าสารกัดกร่อนบางชนิดเช่นโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS), Tris-HCL และ EDTA ซึ่งใช้เพื่อช่วยในการเปลี่ยนสภาพของโปรตีนทำให้พวกมันสูญเสียโครงสร้างดั้งเดิม
นี่เป็นขั้นตอนเบื้องต้นในการเตรียมโปรตีนสำหรับเทคนิคอิเล็กโทรโฟเรซิส ช่วง pH ที่โปรตีนเอสเคทำหน้าที่ค่อนข้างกว้าง (2.0 ถึง 12.0) โดยมีค่า pH ที่เหมาะสมระหว่าง 7.5 ถึง 12.0 และจุดไอโซอิเล็กทริกคือ 8.9 ดังที่เห็นได้ว่ามีการใช้งานกับช่วง pH ที่กว้างมาก
อีกลักษณะหนึ่งที่โดดเด่นในโปรตีนเอสเคคือความเสถียรเมื่อมีอุณหภูมิสูง (50 - 60 ° C)
กิจกรรมของเอนไซม์
Proteinase K ต้องการการมีอยู่ของแคลเซียมไอออนแม้ว่าจะไม่ส่งผลกระทบต่อกิจกรรมของมันหากจำเป็นต้องรักษาความคงตัว
เพื่อให้โปรตีนเอสเคย่อยสารตั้งต้นได้เต็มที่จำเป็นต้องใช้เวลาสัมผัสประมาณ 5 นาทีถึง 2 ชั่วโมง
อย่างไรก็ตามในแง่นี้ Daza et al เปรียบเทียบความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอที่ได้รับในช่วงเวลาต่างๆของการสัมผัสกับโปรตีนเอส K และสรุปได้ว่าการฟักตัวเป็นเวลานาน (สูงสุด 24 ชั่วโมง) ช่วยเพิ่มคุณภาพของดีเอ็นเอได้อย่างมีนัยสำคัญ
อย่างไรก็ตามเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของเอนไซม์โปรตีนเอสเคที่ใช้ในโปรโตคอลที่แตกต่างกันอาจกล่าวได้ว่ามีความหลากหลายมาก
สามารถใช้ได้ตั้งแต่ความเข้มข้นต่ำมาก (5 µg / ml) ถึงความเข้มข้น 500 µg / ml แต่ความเข้มข้นในการทำงานที่พบมากที่สุดมีตั้งแต่ 50–100μg / ml โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการย่อยโปรตีนและการปิดใช้งานนิวคลีเอส แม้ว่าสำหรับการรักษาเนื้อเยื่อจะต้องมีความเข้มข้น 2 มก. / มล.
การประยุกต์ใช้งาน
การใช้งานมีความกว้างมากและสามารถสรุปได้ดังนี้:
- ใช้ในการย่อยโปรตีนและการสกัดดีเอ็นเอด้วยวิธีการต่างๆเช่น salting-out, PK-SDS, cetyl-trimethyl ammonium bromide (CTAB), ดัดแปลงโพแทสเซียมอะซิเตตและการสกัดด้วยโซเดียมไอโอไดด์
- การกระตุ้นนิวคลีเอส (RNases และ DNases)
- ในเทคนิคการผสมพันธุ์ในแหล่งกำเนิด (HIS) เพื่อช่วยในการปลดปล่อยกรดนิวคลีอิกนอกเหนือจากการกำจัดโปรตีนที่ไม่พึงปรารถนา
- การปรับเปลี่ยนโปรตีน
- ในระดับการวิจัยในการศึกษาต่างๆ
ข้อดีของโปรตีนเค
มีการศึกษาเปรียบเทียบหลายครั้งระหว่างเทคนิคการสกัดดีเอ็นเอที่ใช้ Proteinase K กับคนอื่น ๆ ที่ไม่ได้ใช้และทั้งหมดสรุปได้ว่ามีประโยชน์มากกว่าเมื่อใช้เอนไซม์ ข้อดีมีดังต่อไปนี้:
-DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงมีคุณภาพและความบริสุทธิ์สูง
- ดีเอ็นเอที่สกัดได้มีความเสถียรนานถึง 3 เดือน
ดีเอ็นเอที่สกัดได้สามารถใช้ในเทคนิคต่อไปนี้: Southern blot, polymerase chain reaction (PCR), electrophoresis และอื่น ๆ
โปรตีนที่ทนต่อ Proteinase K
การตรวจสอบต่างๆสรุปได้ว่าพรีออน (โปรตีน PrPSc ที่เป็นพิษผิดปกติ) แตกต่างจากโปรตีน PrPC (พื้นเมือง) โดยทนต่อการกระทำของโปรตีนเอสเคในขณะที่ PrPCs มีความไวต่อการกระทำของมัน
ผู้เขียนคนอื่นได้อธิบายว่าในโครงสร้างของ PrPSc มีส่วนที่บอบบางและส่วนอื่น ๆ ที่ทนต่อโปรตีนเอสเคอย่างไรก็ตามทั้งสองส่วนมีความเป็นพิษและติดเชื้อเท่า ๆ กัน
ในทางกลับกัน Bastian et al. ในปี 2530 ได้แยกโปรตีน 4 ชนิด 28, 30, 66 และ 76 kda จาก Spiroplasma mirum ชนิดหนึ่ง พบว่าทุกชนิดทนต่อการออกฤทธิ์ของโปรตีนเอสเคและยังมีปฏิกิริยาข้ามกับพรีออนบางชนิด
เป็นที่ทราบกันดีว่าสายพันธุ์นี้สามารถทำให้เกิดต้อกระจกและความเสียหายทางระบบประสาทที่สำคัญและเนื่องจากการค้นพบทางวิทยาศาสตร์ของ Bastian ในการตรวจสอบอื่น ๆ ได้มีความพยายามที่จะเชื่อมโยงจุลินทรีย์นี้กับ encephalopathies ที่แพร่กระจายได้
อย่างไรก็ตามสาเหตุของพยาธิวิทยาทางระบบประสาทเสื่อมนี้ยังคงเป็นผลมาจากพรีออนในปัจจุบัน
ในแง่นี้บัตเลอร์และคณะในปีพ. ศ. 2534 ได้ระบุและจำแนกประเภทของโปรตีนที่ทนต่อโปรตีนเอสเคที่ 40 kda จาก Mycoplasma hyorhinis สองสายพันธุ์ เชื้อโรคนี้ส่งผลกระทบต่อสุกรทำให้ติดเชื้อในเนื้อเยื่อ แต่ในกรณีนี้ไม่มีปฏิกิริยาข้ามกับพรีออนที่ทดสอบ
จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่ออธิบายสิ่งที่ไม่ทราบจำนวนมากในเรื่องนี้
อ้างอิง
- Bastian F, Jennings R และ Gardner W. 1987. Antiserum กับโปรตีน fibril ที่เชื่อมโยงกับ scrapie ทำปฏิกิริยาข้ามกับโปรตีน Spiroplasma miru m fibril J. Clin. Microbiol 25: 2430-2431
- Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. การประเมินวิธีการสกัดดีเอ็นเอและการทำให้บริสุทธิ์จากเนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อคงที่ของฟอร์มัลดีไฮด์ของศพที่ไม่ระบุชื่อ นิตยสาร Med, 2014; 22 (1): 42-49,
- บัตเลอร์ G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E และ Mcgarrity G. การติดเชื้อและภูมิคุ้มกัน, 2534, 59 (3): 1037-1042
- López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L และอื่น ๆ การเปรียบเทียบโปรโตคอลการสกัด DNA ของ Trypanosoma cruzi สองแบบที่ปลูกในสื่อแอกเซนิก รายได้เปรู Med. Exp. สาธารณสุข 2557; 31 (2): 222-227. มีจำหน่ายที่: scielo.org
- Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E และ Palma W. การกำหนดประสิทธิภาพของโปรโตคอลการสกัดดีเอ็นเอห้าแบบจากวัสดุพาราฟินสำหรับการศึกษาระดับโมเลกุล Rev Méd Univ คอสตาริกา 2007 1 (1): 10-19.