IMMUNOFLUORESCENCE: เหตุผลโปรโตคอลและการใช้งาน - ชีววิทยา

อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพในการสร้างภูมิคุ้มกันโดยใช้แอนติบอดีที่ยึดติดกับโมเลกุลเรืองแสงโควาเลนต์เพื่อระบุเป้าหมายเฉพาะในตัวอย่างเซลล์ที่ยึดติดกับส่วนรองรับที่เป็นของแข็ง

เทคนิคนี้เกี่ยวข้องกับการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่มีความจำเพาะของภูมิคุ้มกันทำให้สามารถสังเกตเซลล์ที่มีชีวิตหรือที่ตายแล้วซึ่งสามารถนำเสนอแอนติเจนในปริมาณเล็กน้อย มีการใช้กันอย่างแพร่หลายทั้งในด้านการวิจัยและการวินิจฉัยทางคลินิกของโรคต่างๆ

การสร้างภูมิคุ้มกันของเส้นใยแอกตินในเซลล์คาร์ดิโอไมโอไซต์ (ที่มา: Ps1415 ผ่าน Wikimedia Commons)

เทคนิคนี้ส่วนใหญ่เป็นเชิงคุณภาพ (โดยมีตัวแปรเชิงปริมาณบางอย่าง) เกี่ยวข้องกับการสร้างภาพตัวอย่างโดยสัญญาณผลิตภัณฑ์ของฟลูออโรฟอร์ซึ่งเป็นโมเลกุลเรืองแสงที่เชื่อมโยงกับแอนติบอดีและสามารถตื่นเต้นได้ที่ความยาวคลื่นหนึ่ง .

ในบริบทของเซลล์จะมีประโยชน์มากในการศึกษาการมี / ไม่มีและตำแหน่งของโปรตีนในเซลล์ เทคนิคนี้ถูกนำมาใช้ในสภาพแวดล้อมทางคลินิกสำหรับการวินิจฉัยไวรัสเช่นไข้หวัดใหญ่และต่อมาสำหรับโรคติดเชื้ออื่น ๆ อีกมากมาย

เป็นเทคนิคที่มีความไวสูงและด้วยอุปกรณ์กล้องจุลทรรศน์ที่เหมาะสมจะมีความละเอียดที่ดีมาก สำหรับการสังเกตต้องใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลหรือเอฟิฟลูออเรสเซนต์

อย่างไรก็ตามแม้จะได้รับความนิยมอย่างมาก แต่ก็สามารถนำเสนอปัญหาที่สำคัญบางประการเกี่ยวกับการได้รับฟลูออเรสเซนต์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงซึ่งทำให้เกิด "เสียงรบกวน" พื้นหลังซึ่งมัก จำกัด การอ่านผลลัพธ์ที่เพียงพอ

รากฐาน

อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ขึ้นอยู่กับการใช้ประโยชน์จากปรากฏการณ์ทางชีววิทยาของปฏิกิริยาปฏิสัมพันธ์ระหว่างแอนติบอดีและแอนติเจน มันต้องทำโดยเฉพาะกับการสร้างภาพหรือการตรวจจับปฏิกิริยานี้โดยโมเลกุลเรืองแสงที่น่าตื่นเต้นไปยังความยาวคลื่นเฉพาะ

แอนติบอดีคือโปรตีนอิมมูโนโกลบูลินที่หลั่งออกมาจากเซลล์บีที่ใช้งานอยู่ซึ่งสร้างขึ้นโดยเฉพาะกับแอนติเจนซึ่งสามารถจับกับความสัมพันธ์และความจำเพาะสูงได้ Immunofluorescence ใช้อิมมูโนโกลบูลิน IgG ซึ่งพบได้ในซีรั่มในเลือด

แอนติบอดีคือโมเลกุลที่มีความสูงถึง 950 kDa ซึ่งประกอบด้วยโซ่เปปไทด์สั้น (เบา) สองสายและยาว "Y" (หนัก) สองสาย ทั้งโซ่เบาและหนักแบ่งออกเป็นสองโดเมน: ตัวแปรเดียวสามารถจดจำแอนติเจนและค่าคงที่หรืออนุรักษ์อื่น ๆ ซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของแต่ละชนิด

แอนติเจนถูกกำหนดตามหน้าที่เป็นโมเลกุลที่แอนติบอดีสามารถรับรู้ได้และโดยส่วนใหญ่แล้วคือโปรตีน เมื่อสัตว์สัมผัสกับแอนติเจนเซลล์ลิมโฟไซต์ของระบบภูมิคุ้มกันจะทำงานโดยสร้างแอนติบอดีต่อมันและทำหน้าที่เป็นระบบป้องกัน

แอนติเจนเช่นโปรตีนอาจมีมากกว่าหนึ่งเอพิโทพีหรือที่ตั้งของการรับรู้โดยแอนติบอดีดังนั้นซีรั่มของสัตว์ที่สัมผัสกับแอนติเจนอาจมีโพลีโคลนอลแอนติบอดีต่อบริเวณต่างๆของโปรตีนเดียวกัน

จากนั้น Immunofluorescence ใช้ประโยชน์จากความสามารถของสัตว์ในการสร้าง polyclonal antibodies ต่อแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจงเพื่อทำให้บริสุทธิ์และใช้ในการตรวจหาแอนติเจนเดียวกันในบริบทอื่น ๆ

ในบรรดาสีย้อมเรืองแสงหรือโมเลกุลที่ใช้มากที่สุดสำหรับเทคนิคอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์บางชนิด ได้แก่ fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate-5 และ 6 (TRITC) ไซยาไนด์หลายชนิดเช่น Cy2, Cy3, Cy5 และ Cy7 และสีย้อมที่เรียกว่า Alexa Fluor® เช่น Alexa Fluor®448

มาตรการ

โปรโตคอลอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์แตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับหลายปัจจัยอย่างไรก็ตามโดยทั่วไปแล้วจะมีลำดับขั้นตอนเชิงเส้นซึ่งประกอบด้วย:

การเตรียมแผ่นและเซลล์
การตรึงตัวอย่าง
permeabilization
การปิดกั้น
การสร้างภูมิคุ้มกันหรือการสร้างภูมิคุ้มกัน
การประกอบและการสังเกต

-Preparation

จากตัวอย่าง

การเตรียมตัวอย่างจะขึ้นอยู่กับลักษณะและประเภทของประสบการณ์ที่จะดำเนินการ กรณีที่ง่ายที่สุดซึ่งเกี่ยวข้องกับการใช้เซลล์ในการระงับจะอธิบายไว้ด้านล่าง

เซลล์ที่อยู่ในสารแขวนลอยนั่นคือในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวจะต้องถูกแยกออกจากมันโดยการหมุนเหวี่ยงก่อนจากนั้นจึงต้องล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์หรือ "บัฟเฟอร์" แบบไอโซโมติกซึ่งจะรักษาความสมบูรณ์ไว้

โดยปกติจะใช้บัฟเฟอร์ฟอสเฟต - น้ำเกลือที่เรียกว่า PBS ซึ่งเซลล์จะถูกนำกลับมาใช้ใหม่และส่วนผสมนี้จะถูกหมุนเหวี่ยงอีกครั้งเพื่อให้ได้เซลล์ที่ปราศจากอาหารเลี้ยงเชื้อซึ่งอาจมีสารรบกวน

ของใบมีด

สไลด์ที่ใช้สำหรับการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์ซึ่งเซลล์จะได้รับการแก้ไขในภายหลังสำหรับการบำบัดปลายน้ำที่เกี่ยวข้องจะต้องได้รับการเตรียมอย่างรอบคอบ

สิ่งเหล่านี้ถูกปิดทับหรือ "ทำให้ไวแสง" ด้วยสารละลายโพลีไลซีนซึ่งเป็นโพลีเมอร์สังเคราะห์ที่จะทำหน้าที่เป็น "กาวโมเลกุล" ระหว่างเซลล์และส่วนรองรับที่เป็นของแข็งเนื่องจากปฏิกิริยาไฟฟ้าสถิตระหว่างประจุบวกของกลุ่มอะมิโนและเซลล์ ประจุลบต่อโปรตีนที่เคลือบเซลล์

การตรึงตัวอย่าง

กระบวนการนี้ประกอบด้วยการตรึงโปรตีนที่พบภายในเซลล์เพื่อรักษาตำแหน่งเชิงพื้นที่ให้สมบูรณ์ โมเลกุลที่ใช้จะต้องสามารถข้ามเยื่อหุ้มเซลล์ทุกชนิดและสร้างตาข่ายกับโปรตีนโควาเลนต์ได้

ฟอร์มาลดีไฮด์และพาราฟอร์มัลดีไฮด์กลูตารัลดีไฮด์และแม้แต่เมทานอลถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายซึ่งตัวอย่างเซลล์จะถูกบ่มในช่วงเวลาหนึ่งแล้วล้างด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ไอโซโมติก

หลังจากแก้ไขเซลล์แล้วเซลล์เหล่านี้จะยังคงยึดติดกับแผ่นที่ไวต่อความรู้สึกด้วยโพลีไลซีนก่อนหน้านี้

permeabilization

ขึ้นอยู่กับประเภทของการทดสอบที่ดำเนินการจำเป็นต้องซึมผ่านเซลล์ที่อยู่ระหว่างการศึกษาหรือไม่ หากสิ่งที่ต้องการคือการทราบตำแหน่งการมีหรือไม่มีโปรตีนบางชนิดบนผิวเซลล์การทำให้ซึมผ่านก็ไม่จำเป็น

ในทางกลับกันหากคุณต้องการทราบตำแหน่งของโปรตีนภายในเซลล์การซึมผ่านเป็นสิ่งสำคัญและจะประกอบด้วยการบ่มตัวอย่างด้วย Triton X-100 ซึ่งเป็นผงซักฟอกที่สามารถซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ได้

การปิดกั้น

ขั้นตอนพื้นฐานในเทคนิคภูมิคุ้มกันทั้งหมดกำลังปิดกั้น ในขั้นตอนนี้การปิดกั้นประกอบด้วยการปิดทับบนแผ่นไวแสงไซต์ทั้งหมดที่มีโมเลกุลโพลีไลซีนที่เซลล์ไม่เกาะติด นั่นคือมันป้องกันไม่ให้สหภาพแรงงานใด ๆ

โดยปกติสำหรับการปิดกั้นสารละลายที่มี bovine serum albumin (BSA) ในบัฟเฟอร์ PBS จะใช้และผลลัพธ์ที่ดีที่สุดจะได้รับยิ่งใช้เวลาฟักตัวนานขึ้นด้วยวิธีนี้ หลังจากแต่ละขั้นตอนรวมถึงการปิดกั้นจำเป็นต้องล้างสารละลายที่เหลือออก

การสร้างภูมิคุ้มกันหรือการสร้างภูมิคุ้มกัน

ขั้นตอนการสร้างภูมิคุ้มกันหรือการสร้างภูมิคุ้มกันจะขึ้นอยู่กับว่าเป็นอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทางตรงหรือทางอ้อม (ดูด้านล่าง)

หากเป็นอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์หลักหรือโดยตรงตัวอย่างจะถูกบ่มด้วยแอนติบอดีที่ต้องการซึ่งจะต้องอยู่คู่กับสีย้อมเรืองแสง ขั้นตอนการฟักไข่ประกอบด้วยการเจือจางของแอนติบอดีในสารละลายที่จะมี BSA ด้วย แต่ในสัดส่วนที่ต่ำกว่า

เมื่อเป็นกรณีของอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทุติยภูมิหรือทางอ้อมควรทำการฟักไข่สองครั้งติดต่อกัน ขั้นแรกด้วยแอนติบอดีที่ต้องการจากนั้นด้วยแอนติบอดีที่สามารถตรวจจับบริเวณคงที่ของอิมมูโนโกลบูลินหลักได้ เป็นแอนติบอดีทุติยภูมิเหล่านี้ที่เชื่อมโยงกับโควาเลนต์กับฟลูออรีน

เทคนิคนี้มีความหลากหลายมากทำให้สามารถติดฉลากแอนติเจนได้มากกว่าหนึ่งตัวต่อหนึ่งตัวอย่างตราบเท่าที่มีแอนติบอดีหลักควบคู่ไปกับฟลูออโรฟลูออเรสเซนต์ที่แตกต่างกันในกรณีของการสร้างภูมิคุ้มกันโดยตรง

สำหรับการติดฉลากพร้อมกันในการสร้างภูมิคุ้มกันทางอ้อมจำเป็นต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าแอนติบอดีหลักแต่ละตัวผลิตในสัตว์ต่างชนิดกันและแอนติบอดีทุติยภูมิแต่ละตัวจะจับคู่กับฟลูออโรฟอร์ที่แตกต่างกัน

เช่นเดียวกับการปิดกั้นการฟักตัวด้วยแอนติบอดีจะให้ผลลัพธ์ที่ดีขึ้นเมื่อเวลาผ่านไปนานขึ้น หลังจากแต่ละขั้นตอนจำเป็นต้องล้างแอนติบอดีส่วนเกินที่ไม่ได้จับกับตัวอย่างและในการสร้างภูมิคุ้มกันทุติยภูมิจำเป็นต้องปิดกั้นก่อนที่จะเพิ่มแอนติบอดีทุติยภูมิ

เทคนิคบางอย่างใช้คราบอื่น ๆ ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการสร้างภูมิคุ้มกันเช่นการย้อมสีดีเอ็นเอนิวเคลียร์ด้วยฟลูออโรฟอร์ DAPI

การประกอบและการสังเกต

ในช่วงเวลาฟักตัวสุดท้ายด้วยฟลูออโรฟอสฟอรัสจำเป็นต้องให้ตัวอย่างอยู่ในที่มืด สำหรับการสังเกตด้วยกล้องจุลทรรศน์เป็นเรื่องปกติที่จะใช้สารบางชนิดเพื่อรักษาการเรืองแสงของฟลูออโรโฟรีควบคู่ไปกับแอนติบอดี

ประเภท

สรุปกราฟฟิคของอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทั้งทางตรงและทางอ้อม (ที่มา: Westhayl618 ผ่าน Wikimedia Commons)

อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยตรงหรือหลัก

เกี่ยวข้องกับการตรวจหาแอนติเจนโดยใช้แอนติบอดีเรืองแสง ข้อได้เปรียบหลักของการใช้เทคนิคนี้คือความเร็วอย่างไรก็ตามหลายกรณีของการผูกแบบไม่เฉพาะเจาะจงสามารถเกิดขึ้นได้ในกระบวนการนี้โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อศึกษาซีร่าของมนุษย์เนื่องจากพวกมันอุดมไปด้วยแอนติบอดีที่แตกต่างกันสูง

อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทางอ้อมหรือทุติยภูมิ

เป็นที่รู้จักกันในชื่อเทคนิค "แซนวิช" ซึ่งเกี่ยวข้องกับการพัฒนาเทคนิคในสองขั้นตอน สิ่งแรกเกี่ยวข้องกับการใช้แอนติบอดีที่ไม่เรืองแสงและการจับกับแอนติเจนที่น่าสนใจ

เมื่อเทียบกับพื้นที่คงที่ของแอนติบอดีตัวแรกนี้ (ซึ่งตอนนี้จะทำหน้าที่เป็นแอนติเจน) แอนติบอดีตัวที่สองที่สามารถรับรู้ได้ถูกใช้ซึ่งเกี่ยวข้องกับโมเลกุลเรืองแสง

การปรากฏตัวของสัญญาณเรืองแสงจะเป็นผลมาจากการรับรู้ที่เฉพาะเจาะจงระหว่างแอนติบอดีที่ไม่เรืองแสงตัวแรกกับแอนติเจนที่สนใจ การปรากฏตัวของเงื่อนไขแอนติบอดีแรกนี้ของเงื่อนไขที่สองซึ่งมีข้อความกำกับและขอบคุณที่สามารถระบุได้ว่ามีหรือไม่มีแอนติเจน

แม้จะเป็นเทคนิคที่ใช้เวลานานกว่าการสร้างภูมิคุ้มกันโดยตรง (เนื่องจากรวมถึงขั้นตอนการฟักตัวอีกหนึ่งขั้น) แต่เทคนิคนี้ไม่เกี่ยวข้องกับการออกแบบแอนติบอดีเรืองแสงสำหรับแอนติเจนแต่ละตัวที่ศึกษาซึ่งส่งผลในแง่เศรษฐกิจ ทำงานได้มากขึ้น

นอกจากนี้ยังเป็นเทคนิคที่ไวกว่าในแง่ของการขยายสัญญาณเนื่องจากแอนติบอดีทุติยภูมิมากกว่าหนึ่งตัวสามารถจับกับบริเวณคงที่ของแอนติบอดีหลักได้ดังนั้นจึงขยายความเข้มของสัญญาณเรืองแสง

การประยุกต์ใช้งาน

ดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์เป็นเทคนิคที่หลากหลายมากซึ่งถูกนำมาใช้ในหลาย ๆ ด้านในสาขาวิทยาศาสตร์และทางคลินิก สามารถใช้เพื่อตอบคำถามทางนิเวศวิทยาพันธุกรรมและสรีรวิทยาเกี่ยวกับสิ่งมีชีวิตหลายชนิด

ในการใช้งานทางคลินิกใช้สำหรับการวินิจฉัยโดยตรงของโรคผิวหนังบางชนิดไม่ว่าจะเป็นการใช้อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์โดยตรงหรือโดยอ้อมกับเนื้อเยื่อบุผิวของผู้ป่วยที่ศึกษา

เทคนิคอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์มีอยู่ในสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียวเช่นยีสต์เพื่อแสดงภาพ microtubules ภายในนิวเคลียสและไซโตพลาสซึมแอคตินและโปรตีนที่เกี่ยวข้องเส้นใย 10 นาโนเมตรและองค์ประกอบอื่น ๆ ของไซโทพลาซึมเมมเบรนและผนังเซลล์

อ้างอิง

Abcam, Immunocytochemistry และ immunofluorescence protocol สืบค้นจาก abcam.com
Greph, C. (2555). สีย้อมเรืองแสง สืบค้นจาก leica-microsystems.com
Miller, DM และ Shakest, DC (1995) กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์. ใน Methods in Cell Biology (Vol. 48, pp. 365–394) สำนักพิมพ์วิชาการ, Inc.
Odell, ID, & Cook, D. (2013). เทคนิค Immunofluorescence Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4
Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). วิธีการอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์สำหรับยีสต์ In Methods of Enzymology (Vol. 194, pp. 565–602). สำนักพิมพ์วิชาการ, Inc.
Schaeffer, M. , Orsi, E.V, & Widelock, D. (1964). การใช้อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ในไวรัสวิทยาสาธารณสุข บทวิจารณ์ทางแบคทีเรีย, 28 (4), 402–408.
Vrieling, EG, & Anderson, DM (1996). อิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ในการวิจัยแพลงก์ตอนพืช: การใช้งานและศักยภาพ J: Phycol , 32, 1–16

IMMUNOFLUORESCENCE: เหตุผลโปรโตคอลและการใช้งาน - ชีววิทยา - 2025